一种长效化艾塞那肽的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种长效化艾塞那肽的制备方法及其应用，属于药物肽制备技术领域。本发明专利技术长效化艾塞那肽的制备过程包括：将艾塞那肽的序列融合构建到DARPin的N端，艾塞那肽与DARPin之间使用5个甘氨酸作为linker将艾塞那肽

【技术实现步骤摘要】
一种长效化艾塞那肽的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及药物肽制备
，具体涉及一种长效化艾塞那肽的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]艾塞那肽是一种胰高血糖素样肽
‑
1(GLP
‑
1)类似物，序列为：
[0003]His
‑
Gly
‑
Glu
‑
Gly
‑
Thr
‑
Phe
‑
Thr
‑
Ser
‑
Asp
‑
Leu
‑
Ser
‑
Lys
‑
Gln
‑
Met
‑
Glu
‑
Glu
‑
Glu
‑
Ala
‑
Val
‑
Arg
‑
Leu
‑
Phe
‑
Ile
‑
Glu
‑
Trp
‑
Leu
‑
Lys
‑
Asn
‑
Gly
‑
Gly
‑
Pro
‑
Ser
‑
Ser
‑
Gly
‑
Ala
‑
Pro
‑
Pro
‑
Pro
‑/>Ser
‑
NH2。
[0004]艾塞那肽主要用于治疗II型糖尿病。艾塞那肽具有GLP
‑
1受体激动剂作用，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP
‑
1相似。艾塞那肽的分子结构与GLP
‑
1的同源性达53％，结构差异表现在：C端多出9个氨基酸，不易被肽链内切酶降解；N端第二个氨基酸为甘氨酸，不会被二肽基肽酶IV(DPP
‑
IV)分解。特殊的分子结构使艾塞那肽在血浆中的半衰期长达9.57小时，患者每天注射两次且低血糖发生风险小，当血糖升高时，艾塞那肽能够升高细胞内cAMP，诱导胰岛素释放；当血糖降低时，其诱导胰岛素释放的作用即会消退。然而，由于蛋白质/多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物通常需要在一天之内多次注射，这给病人带来了许多痛苦和诸多不便。
[0005]现有技术中公布了很多制备艾塞那肽的方法以及延长艾塞那肽半衰期的方法，例如CN102532303A公开了使用甲氧基聚乙二醇残基与艾塞那肽分子中赖氨酸残基的氨基或N末端组氨酸残基的氨基缀合，合成聚乙二醇(PEG)缀合的艾塞那肽的方法；CN101980725A公开了脂肪酸
‑
PEG
‑
艾塞那肽的结构，并且PEG的修饰位点在N端His上。然而，使用PEG的缺点在于不能形成均一的产物；使用脂肪酸链修饰的链接的缺点在于工艺复杂，成本较高。需开发新的艾塞那肽衍生物，使其在体内作用时间长，稳定性好，降糖效果好，同时保持低毒性和较好的活性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种半衰期长的长效化艾塞那肽的制备方法；本专利技术的另一个目的在于提供一种能够作为药物载体用于制备长效化艾塞那肽的DARPin蛋白。
[0007]为达到上述专利技术目的，采用如下技术方案：
[0008]一种长效化艾塞那肽的制备方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1：设计长效化艾塞那肽序列，序列中包含DARPin序列；
[0010]步骤2：表达和纯化长效化艾塞那肽；
[0011]其中DARPin的序列如SEQIDNO.1所示。
[0012]DARPin作为药物载体，用于提高艾塞那肽在体内的半衰期，以提高艾塞那肽降血糖能力。
[0013]优选地，步骤1中长效化艾塞那肽的结构为6His
‑
酶切位点
‑
艾塞那肽
‑
Linker
‑
DARPin；
[0014]其中，6His为组氨酸纯化标签，其氨基酸序列为His
‑
His
‑
His
‑
His
‑
His
‑
His；
[0015]Linker为连接肽，其氨基酸序列为：Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly；
[0016]艾塞那肽氨基酸序列为：
[0017]His
‑
Gly
‑
Glu
‑
Gly
‑
Thr
‑
Phe
‑
Thr
‑
Ser
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Asp
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Leu
‑
Ser
‑
Lys
‑
Gln
‑
Met
‑
Glu
‑
Glu
‑
Glu
‑
Ala
‑
Val
‑
Arg
‑
Leu
‑
Phe
‑
Ile
‑
Glu
‑
Trp
‑
Leu
‑
Lys
‑
Asn
‑
Gly
‑
Gly
‑
Pro
‑
Ser
‑
Ser
‑
Gly
‑
Ala
‑
Pro
‑
Pro
‑
Pro
‑
Ser。
[0018]长效化艾塞那肽能够在在剂量较低的情况下长时间有效降低血糖浓度。
[0019]优选地，酶切位点为TEV酶切位点，其氨基酸序列为：
[0020]Glu
‑
Asn
‑
Leu
‑
Tyr
‑
Phe
‑
Gln
‑
Gly。
[0021]更优选地，步骤1包括：
[0022]将艾塞那肽的序列融合构建到DARPin的N端，艾塞那肽
‑
DARPin之间使用5个甘氨酸作为linker，形成艾塞那肽
‑
(Gly)5‑
DARPin。
[0023]优选地，步骤2包括：
[0024]步骤2
‑
1：构建表达载体；
[0025]步骤2
‑
2：长效化艾塞那肽的表达；
[0026]步骤2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长效化艾塞那肽的制备方法，包括如下步骤：步骤1：设计长效化艾塞那肽序列，序列中包含DARPin序列；步骤2：表达和纯化长效化艾塞那肽；其中DARPin的序列如SEQIDNO.1所示，长效化艾塞那肽序列如SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中长效化艾塞那肽的结构为6His
‑
酶切位点
‑
艾塞那肽
‑
Linker
‑
DARPin；其中，6His为组氨酸纯化标签，其氨基酸序列为His
‑
His
‑
His
‑
His
‑
His
‑
His；Linker为连接肽，其氨基酸序列为：Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly；艾塞那肽氨基酸序列为：His
‑
Gly
‑
Glu
‑
Gly
‑
Thr
‑
Phe
‑
Thr
‑
Ser
‑
Asp
‑
Leu
‑
Ser
‑
Lys
‑
Gln
‑
Met
‑
Glu
‑
Glu
‑
Glu
‑
Ala
‑
Val
‑
Arg
‑
Leu
‑
Phe
‑
Ile
‑
Glu
‑
Trp
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：高国生，李建辉，蔡挺，张嫦珍，
申请(专利权)人：中国科学院大学宁波华美医院，
类型：发明
国别省市：