胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法技术

本发明专利技术公开了一株分泌表达胶原蛋白肽

【技术实现步骤摘要】
胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法
(一)

[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体的是一种胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法。
(二)
技术介绍

[0002]乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是1960年Groves首先从牛乳分离出来的，由于乳铁蛋白与铁结合形成红色的复合物，故始称为“红蛋白”。乳铁蛋白是一种糖蛋白，存在于哺乳动物多个腺体中，如乳汁、泪液、唾液和其他外分泌液或中性粒细胞、血浆中，研究表明在初乳中含量最高。
[0003]牛乳铁蛋白由于抗菌活性和抑制非正常细胞的生长的能力而具有调节机体免疫力能力的作用，并被广泛应用于饲料和食品添加剂、化妆品以及医药等行业。牛乳铁蛋白具有较高等电点，蛋白表面带正电，是一种碱性蛋白，其具有抗菌，抗病毒，参与铁代谢，参与免疫调节，抗氧化和抑制肿瘤细胞等多种生物学功能，已经作为一种抗菌肽和营养物质并具有重要的研究价值。牛乳铁蛋白的稳定性与pH、温度、盐类及缓冲液环境等多种因素相关。已对牛乳铁蛋白在不同温度下的热稳定性进行了研究，结果表明，超高温瞬时法在一定程度上会破坏牛乳铁蛋白的活性，而巴氏消毒法则不会破坏其活性。
[0004]牛乳铁蛋白经消化道分解变成25个氨基酸残基按顺序构成的较小的多肽，这些多肽是牛乳铁蛋白中第17～41位氨基酸残基，这些活性小肽和细胞功能关系密切，可以增强正常细胞的水平，破坏非正常细胞，这些特性使牛乳铁蛋白具有抑菌、杀灭细菌以及防止微生物感染细胞的作用。r/>[0005]就目前研究报道中，Montoya等利用大肠杆菌表达系统表达重组牛乳铁蛋白，其产量为15.3mg/L，并且验证了牛乳铁蛋白的抗菌活性。Rosano等研究表明，原核表达系统表达的蛋白对细胞本身产生毒性而影响细胞的正常生长。2002年，Wang等利用毕赤酵母表达猪乳铁蛋白，表达量为12mg/L；Paramasivam等利用毕赤酵母表达马乳铁蛋白，表达量达到了40mg/L。2006年，Dong等利用毕赤酵母表达耗牛乳铁蛋白，表达量为40mg/L。2007年，Chen等利用毕赤酵母表达羊乳铁蛋白，表达量为2mg/L。2019年，Sun等采用融合表达的方法将牛乳铁蛋白N端与其他抗菌肽融合，表达量为35.6mg/L。Isui和Jose等人成功克隆了牛乳铁蛋白肽(LfcinB)的cDNA基因，与硫氧还蛋白组成融合蛋白，构建pET32
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bLf重组表达载体，转入大肠杆菌进行表达，经过镍柱分离纯化后，产量为15.3mg/L；Zigang Tian等人设计合成LfcinB衍生肽多聚体序列，插入表达载体pET32a，IPTG诱导表达，表达量最高达到10mg/L；易俊波等人将LfcinB基因片段克隆到分泌型表达载体pPIC9K中，得到重组质粒，线性化电转毕赤酵母，经甲醇诱导后，LfcinB在酵母中获得了表达，但需要浓缩10倍才能在SDS
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PAGE胶上看见明显条带，说明其表达量很低。综合文献结果分析表明，牛乳铁蛋白及牛乳铁蛋白肽在分泌表达中产量都相对较低，无法达到生产需求，目前并无表达量高的规模化生产牛乳铁蛋白肽的报道。
[0006]胶原蛋白(COL)是一种生物高分子，它广泛存在于动物结缔组织中，约占体内蛋白
总量的25％
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30％，是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白。由于其良好的生物活性、生物相容性以及生物降解性，它在生物医学、食品和化妆品等领域都有着广泛的应用。胶原蛋白在毕赤酵母表达系统中已有较高的产量，Werten等在毕赤酵母中表达重组明胶(胶原蛋白部分水解后的产物)，其单拷贝表达量达到3
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6g/L；Olsen等研发了小分子质量的重组人源性明胶，其长度仅为101个氨基酸，并利用毕赤酵母进行表达，经过高拷贝的筛选后发酵制备了具有生物活性的人源性明胶，产量达到1.47g/L。综上，胶原蛋白在毕赤酵母中的表达量普遍较高，能利用其良好的生物学性质，通过与牛乳铁蛋白肽融合表达来增加牛乳铁蛋白肽的产量及保持牛乳铁蛋白肽原有的抗菌效果。因此本研究使用毕赤酵母作为宿主，构建一株分泌表达量高的胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白重组巴斯德毕赤酵母菌株。
(三)
技术实现思路

[0007]为了解决现有技术存在的牛乳铁蛋白产量低的问题，本专利技术提供一种胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的基因、含所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白基因的重组质粒、表达所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的菌株以及所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的表达方法。
[0008]为此，本专利技术构建了一株分泌表达胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的重组毕赤酵母菌株，编码该重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列缩写如SEQ ID NO:6所示。以胶原蛋白肽作为标签更好的引导牛乳铁蛋白肽的表达，从而解决牛乳铁蛋白肽产量很低的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白，所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白包括牛乳铁蛋白肽和连接于所述牛乳铁蛋白肽N端的胶原蛋白肽，所述牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]优选地，所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种上述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因。
[0013]优选地，所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0014]优选地，所述的胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白，所选择的宿主为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，且编码融合蛋白的核苷酸序列中的罕见密码子都优化为毕赤酵母偏好的密码子序列。
[0015]进一步地，所述的胶原蛋白肽选取人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4，来源于Homo sapiens)，并根据其序列的亲疏水性分析优选一段亲水性好的胶原蛋白氨基酸序列并与牛乳铁蛋白肽连接，其序列位于去端肽Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链序列的1824
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3204位核苷酸。
[0016]其中，所述的胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白，编码胶原蛋白肽(COL)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0017]所述的胶原蛋白肽
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白，其特征在于：所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白包括牛乳铁蛋白肽和连接于所述牛乳铁蛋白肽N端的胶原蛋白肽，所述牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.如权利要求1所述的胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白，其特征在于：所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。3.如权利要求1所述的胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因。4.如权利要求3所述的胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。5.一种含如权利要求3所述的胶原蛋白肽
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牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒。6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒的载体为pPIC9K质粒。7.如权利要求6所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒按如下方法构建：(1)将如SEQ ID NO:1所示的胶原蛋白肽基因和如SEQ ID NO:3所示的牛乳铁蛋白肽基因分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切法连接到pPIC9K质粒的多克隆位点上，分别得到pPIC9K
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COL质粒和pPIC9K
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LfcinB质粒；(2)以步骤(1)制备的pPIC9K
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COL质粒为模板，用下列引物扩增出pPIC9K
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COL载体片段：COLZT
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F：TAATACGTAGAATTCCCTAGGGCGCOLZT
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R：TCCGTAGTAAGGGGCGAATCC以步骤(1)制备的pPIC9K
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LfcinB质粒为模板，用下列引物扩增出LfcinB片段：LfcinBPD
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F：GATTCGCCCCTTACTACGGATTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGALfcinBPD
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R：CTAGGGAATTCTACGTATTAGAAAGCTCTTCTAACACAAGTAATAGATG(3)将步骤(2)所述的pPIC9K
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COL载体片段与LfcinB片段利用一步克隆试剂盒进行无缝连接，所得产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏春，刘春，刘心雨，刘辰龙，阮柯钦，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：