一种表达B7-H4阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达B7

【技术实现步骤摘要】
一种表达B7-H4阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达B7-H4阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用。

技术介绍

[0002]B7-H4(B7H4,又称B7s1和B7x)是B7家族中的一员。B7-H4蛋白由信号肽区、一对V、C免疫球蛋白外段、跨膜区和胞浆区组成，属于I型跨膜糖蛋白，通过GPI铆定于细胞膜。而H4通过GPI交联有利于接近主要组织相容性复合体(MHC)分子并且这样的空间结构有利于负性共刺激作用的介导。B7H4表达在专职抗原呈递细胞(APC)，并广泛分布在非淋巴组织上。它能通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期的进程来负性调控T细胞的免疫应答。近年来研究发现，B7-H4在多种肿瘤细胞中，如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、肾癌、黑色素瘤等细胞表面呈高表达，B7-H4的表达与肿瘤的分裂、分期和预后密切相关。而且在肿瘤的血管内皮细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞和树突状细胞表面也高表达。采用免疫组织化学技术检测了肺癌、结直肠癌，乳腺癌、胃癌等患者肿瘤组织中B7-H4的表达，发现上述肿瘤组织高表达B7-H4。B7-H4也可以可溶性形式(soluble B7-H4，sB7-H4)存在于人的血液和其他体液中，目前已经发现多种肿瘤患者外周血中sB7-H4水平升高。在一些动物模型中发现B7-H4在肿瘤细胞上高表达，能够抑制细胞凋亡和刺激肿瘤生长。B7-H4有广泛而多样的糖基化，这是肿瘤细胞逃避免疫监视的屏障。在肿瘤的进展中，B7-H4扮演了转化癌症前期细胞并使之逃避免疫监视的角色，比如在卵巢癌的免疫缺陷小鼠模型中，高表达B7-H4能刺激肿瘤的形成，主要通过刺激细胞增殖，增加细胞粘附，转移和侵袭来实现，这说明了B7-H4也许独立于免疫之外的直接刺激肿瘤形成的因素。正常上皮细胞过表达B7-H4会导致其恶性转变，主要是抑制了细胞的凋亡。在体外实验中，用siRNA干扰B7-H4基因的肿瘤细胞株会加速凋亡。因此，B7-H4已成为治疗肿瘤的新靶点，B7-H4阻断物(抗B7-H4抗体)可作为肿瘤治疗药物。然而，抗B7-H4抗体的作用时间短，需要长期进行注射，对于病人来说需要花费高昂的费用。
[0003]干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，在免疫应答、衰老、肿瘤发生等重大生物学活动中发挥着核心且不可替代的作用。依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)和成体干细胞(adult stem cell)。其中，多能干细胞PSCs具备几近无限的自我更新能力，以及在正常发育条件下向胚内所有胚层的器官、组织、细胞发育分化的潜能，典型的PSCs主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EGCs)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells，ECCs)，以及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)等，这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛的应用前景。
[0004]因此，开发一种可以在人体中表达B7-H4阻断物的多能干细胞或其衍生物具有重
要意义。
[0005]但是，无论是自体iPSCs细胞库，还是免疫配型PSCs细胞库的构思或建立都需要花费极大的财力、物力和人力。同种异基因供受体的器官、组织或细胞移植的分子免疫学基础主要是基于经典的主要组织相容性复合体MHC-I和MHC-II(人又作HLA-I、HLA-II)的配型。截至2019年6月，已鉴定和命名的HLA系统等位基因已超过20000个，仅经典的HLA-A、B、C的等位基因数分别都超过5000个，这些经典的HLA-I/II型等位基因各种可能的随机组合将是天文数字，并且随着新的等位基因的发现组合数随之增加，给器官、组织、细胞移植前的组织配型及供体选择带来极大的障碍，也给构建覆盖人群免疫配型PSCs细胞库带来巨大的困难。
[0006]于是，构建同种异体免疫兼容的通用型PSCs迫在眉睫。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。
[0007]为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA-A、HLA-B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA-C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA-C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA-C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA-I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA-C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。
[0008]此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

技术实现思路

[0009]为了克服现有技术所存在的不足，本专利技术的第一方面的目的，在于提供一种表达
B7-H4阻断物的多能干细胞或其衍生物，包括表达B7-H4阻断物的非免疫兼容的多能干细胞或其衍生物、表达B7-本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达B7-H4阻断物的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有B7-H4阻断物的表达序列，所述B7-H4阻断物为抗B7-H4抗体。2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的B2M和/或CIITA基因被敲除。3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入一种或多种免疫兼容分子表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。4.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。5.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：(1)免疫耐受相关基因，包括CD47或HLA-G；(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；(3)主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；(4)主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。6.根据权利要求5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述B2M的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5中的至少一种；所述CIITA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.15中的至少一种；所述HLA-A的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18中的至少一种；所述HLA-B的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.24中的至少一种；所述HLA-C的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.30中的至少一种；所述HLA-DRA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的至少一种；所述HLA-DRB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.45中的至少一种；所述HLA-DRB3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47中的至少一种；
所述HLA-DRB4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.48～SEQ ID NO.57中的至少一种；所述HLA-DRB5的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.66中的至少一种；所述HLA-DQA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.73中的至少一种；所述HLA-DQB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.74～SEQ ID NO.83中的至少一种；所述HLA-DPA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.84～SEQ ID NO.93中的至少一种；所述HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.94～SEQ ID NO.103中的至少一种。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淋立，陈月花，莫健，杨建国，
申请(专利权)人：王淋立，
类型：发明
国别省市：