用于测定微生物样品对抗生素的抗药性的方法以及样品载板技术

本发明专利技术涉及用于测定微生物样品对抗生素的抗药性的方法以及样品载板。所述方法使用了具有多个直径为2至4毫米的明确标记的测试点的样品载板，其中在所述样品载板的测试点上在一定体积的液体中将所述微生物样品和所述抗生素混合，并且在所述测试点上通过质谱测量进行分析，从而确定所述抗生素是否经酶催化改变。所述方法在一个小时内即可测定微生物的抗药性。药性。药性。

【技术实现步骤摘要】
用于测定微生物样品对抗生素的抗药性的方法以及样品载板
[0001]本申请是申请日为2016年4月8日，专利技术名称为“微生物抗药性的质谱快速检测”的中国专利申请No.2016102169174的分案申请。


[0002]本专利技术涉及微生物对抗生素的抗药性的测定，所述微生物特别是产生β
‑
内酰胺酶的那些微生物。

技术介绍

[0003]出版物WO 2011154517 A1(M.Kostrzewa、K.Michelmann和K.Sparbier)及同族出版物DE 102010023452 B4和US 20130095511 A1介绍了一种微生物β
‑
内酰胺酶抗药性测定方法，其基于质谱测量微生物β
‑
内酰胺酶对β
‑
内酰胺抗生素(或具有相似结构的底物)的酶催化改变。为此，向含有β
‑
内酰胺抗生素(或具有相似结构的底物)的溶液中引入细菌，并进行培养例如大约三小时。然后优选通过离心或过滤分离细菌。之后将一至两微升不含细菌的溶液施加至质谱样品载板上，干燥并包被基质溶液以进行基质辅助激光解吸电离(MALDI)。在具有MALDI离子源的飞行时间质谱仪中测量生成质谱，可通过它来确定是否存在经酶催化改变的抗生素或底物，特别是β
‑
内酰胺环的水解分裂，这表示微生物具有抗药性。
[0004]在出版物WO 2012/023845 A1(Luider等人)中介绍了一种类似方法，其大体上通过质谱测定微生物酶导致的抗生素的改变。
[0005]这些文件所述的方法都有较多的单独步骤，特别是离心或过滤，这既需要很长时间，通常又涉及人工操作过程。已知方法通常需要三个小时左右。对于工作量更小、更易于自动化且速度更快、能够以较少样品数量产生高样品通量的微生物抗药性测定方法，始终存在需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的
[0007]本专利技术目的是提供这样的方法和仪器，通过该方法和仪器，可以通过质谱，只使用很少的单独步骤，优选在一个小时内，测定基于抗生素的酶催化改变的微生物抗药性。
[0008]专利技术简述
[0009]本专利技术提供一种用于测定微生物样品对抗生素的抗药性方法，其中在样品载板的测试点上在一定体积的液体中将所述微生物样品和所述抗生素混合，并且在所述测试点上通过质谱测量分析所述抗生素是否经酶催化改变。质谱测量的质量范围优选小于1000道尔顿，特别是介于250至750道尔顿。
[0010]抗生素可以是选自青霉素类(苄青霉素、口服青霉素(oral penicillins)、氨基青霉素、异恶酰基青霉素(isoxacylpenicillins)、酰氨基青霉素)、头孢菌素类、单环β
‑
内酰胺类或碳青霉烯类的组中的β
‑
内酰胺抗生素。微生物样品还可以与包含β
‑
内酰胺抗生素和
β
‑
内酰胺酶抑制剂的复方药品混合，所述复方药品例如克拉维酸与阿莫西林的组合、他佐巴坦与哌拉西林的组合、或舒巴坦与β
‑
内酰胺抗生素的组合。微生物样品还可以在测试点上与多于一种抗生素混合。
[0011]例如可通过由相应的质量信号所显示出的抗生素减少或一种或多种分解产物的增多，或二者，来测定抗生素的酶催化改变。特别地，可通过与参考物质的质量信号进行比较来确定抗生素的减少。在这种情况中，在微生物样品与抗生素混合之前，测试点可以已经包被有参考物质。还可以在它们混合之后或在制备适合质谱测量的样品(例如MALDI样品)期间添加参考物质。
[0012]在优选实施方案中，在具有MALDI离子源的质谱仪(特别是飞行时间质谱仪)中进行质谱测量，其中质谱样品载板是平的并具有多个测试点。
[0013]在另一实施方案中，微生物样品优选具有完整的微生物细胞。在根据本专利技术的方法中，微生物细胞在一定体积的液体中的培养期小于一小时，例如优选仅约半小时。在一定体积的液体中的培养优选在室温下进行。施加至测试点上的微生物细胞的数目优选介于103至107。当使用完整的微生物细胞时，在制备用于质谱测量的样品期间，特别是制备MALDI样品期间，微生物细胞仍保持完整(即未被消化)是有利的。
[0014]微生物样品可包括取自平板培养基(例如琼脂平板)的菌落的完整微生物细胞，或通过离心或过滤从液体培养基分离出的完整微生物细胞。特别地，液体营养基可以是阳性血液营养基，其中血细胞优选在离心或过滤前被破坏。微生物样品还可以是未经培养的体液样品，例如血液样品、尿液样品、或脊髓液样品或涂片样品。涂片样品是取自伤口或粘膜(口、鼻、尿道、阴道、肛门)表面的用于分析的内源物质。
[0015]在另一实施方案中，微生物样品包括被消化的微生物细胞(细胞裂解产物)，在这种情况中，也可在测试点进行微生物消化。如果通过在测试点制备MALDI样品来消化微生物样品中的完整微生物细胞，或者如果微生物样品是细胞裂解产物，那么在质谱测量中还可采集微生物蛋白质的质量信号。这些信号还可用于微生物分类学鉴定和/或在其抗药性方面对其进行进一步表征。微生物样品还可通过以下方法获得，使用不含任何抗生素的液体对平板培养基上的菌落进行微生物细胞采样，然后将样品液体(作为微生物样品)与样品载板上的抗生素混合。
[0016]在另一实施方案中，测试点上的所述一定体积的液体小于10微升，优选小于5微升，特别是介于1至3微升。在样品载板的测试点上混合微生物样品和抗生素之后，样品载板优选保持在潮湿环境中，或向测试点添加额外的液体，以防止所述一定体积的液体在指定培养期或反应时间内干燥殆尽。
[0017]此外，本专利技术还提供了用于微生物样品的抗药性质谱测定的样品载板，其中所述样品载板具有多个测试点，并且至少一个测试点包被有一定剂量的一种或多种抗生素。不同的测试点可以包被有不同的抗生素。此外，每个测试点还可包被有一种或多种参考物质。
[0018]原则上，可以使用任何质谱仪进行质谱测量，例如四极过滤器
[0019](特别是三重四极质谱仪)、正交离子注入飞行时间质谱仪(OTOF)、离子回旋共振质谱仪(ICR
‑
MS)、静电Kingdon质谱仪或离子阱质谱仪。特别有利的是，使用目前常用于鉴定微生物(特别是细菌)、并且通常在线性模式下运行且无反射器的相同MALDI飞行时间质谱仪。
可以分解大范围的β
‑
内酰胺抗生素。ESBL最初由β
‑
内酰胺酶上的点突变形成。ESBL和碳青霉烯酶的基因见于可从细菌到细菌水平传递的质粒。
[0028]携带ESBL的细菌对青霉素、头孢菌素(1
‑
4代)及单环β
‑
内酰胺类有抗药性。主要是携带ESBL基因的大肠杆菌(E.coli)和克雷伯杆菌属(Klebsiella)(革兰氏阴性菌)。微生物学家们忧心忡忡，因为这些ESBL抗药性和碳青霉烯抗药性快速蔓延。除了甲氧西林抗药性金黄色葡萄球菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于测定微生物样品对抗生素的抗药性的方法，该方法使用了具有多个直径为2至4毫米的明确标记的测试点的样品载板，其中在所述样品载板的测试点上在一定体积的液体中将所述微生物样品和所述抗生素混合，并且在所述测试点上通过质谱测量进行分析，从而确定所述抗生素是否经酶催化改变，其特征在于，
‑
所述样品载板在所述测试点上包括所述抗生素以及一种或多种参考物质的层，其中所述一种或多种参考物质用于确定所述抗生素的质量信号的量变，包括所述抗生素的分解产物的质量信号的量变，以及
‑
所述层包含0.1微克至2微克的抗生素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述测试点包括亲水表面并且嵌入疏水环境中。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述质谱测量的质量范围介于250至750道尔顿。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述经酶催化改变是在室温下不超过半小时的培养之后检测到的分解。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述测试点上的层包含降低微生物酶的效力的抑制剂。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述一种或多种参考物质包含硫胺。7.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：(a)提供样品载板，所述样品载板具有多个直径为2至4毫米...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡特里，
申请(专利权)人：布鲁克，
类型：发明
国别省市：