一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒，包括溶解液、淀粉显色液、比色卡和检测试纸；其中，检测试纸为砂纸，比色卡包括不同淀粉浓度对应的显色照片；该试剂盒操作简单且操作所需时间短，滴入碘液后即时检测出结果，利于田间的即时取样检测，具有快速高效简便的特点，而且比色的界限清晰，判定准确，显著提高检测准确率；本发明专利技术公开了一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的方法，该方法简单、易操作且检测准确率高。易操作且检测准确率高。易操作且检测准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及柑橘黄龙病检测
，具体涉及一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]在我国柑橘黄龙病主要是由柑橘韧皮杆菌的亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus)所导致，黄龙病的传播包括嫁接、柑橘木虱传播以及带病(虫)柑橘苗木的私调乱引增多，黄龙病的传播导致该病有逐年扩大的趋势；目前黄龙病仍然没有治愈的办法，该病极易传播，而且树体感染病菌后在5年到10年死亡，造成柑橘绝产；目前只能通过砍树、控制木虱和改种其他品种果树来缓解黄龙病的扩散，但是这些措施仍然无法有效遏制黄龙病的蔓延；据统计中国柑橘总量占世界柑橘总量的12％，然而黄龙病发生对我国的柑橘产业特造成了巨大的威胁；柑橘从种植到丰产要七八年左右，而黄龙病的发生毁掉了果农近十年的心血，给农户造成了巨大的经济损失，对于我国整个柑橘产业而言，黄龙病始终是无法绕开的核心课题。
[0003]黄龙病的快速检测特别是在能为广大农户广泛使用的便捷快速检测方法是整个黄龙病防控的关键一环，目前柑橘黄龙病的检测方法包括使用荧光定量PCR方法进行检测、基于单克隆抗体技术进行检测、采用目测的方法来观察黄龙病的有无以及基于碘淀粉反应的诊断方法进行检测。
[0004]使用荧光定量PCR方法进行检测例如通过改进引物或者PCR方法进行黄龙病的检测，该方法需要从柑橘叶片叶柄处分离提取柑橘黄龙病病菌的DNA，然后通过特异引物进行荧光定量PCR检测，而且对样品的处理和柑橘黄龙病病菌DNA的提取需要一定的技术和经验，具有耗时长、技术难度高且检测成本较高的缺陷，而且平均一个样品的费用在150元
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200元左右，极大限制了该方法的大规模田间应用；基于单克隆抗体技术进行检测包括制备与黄龙病病菌的特异蛋白质结合而不与健康叶片发生结合的单克隆抗体，对柑橘黄龙病进行ELISA检测，这种方法具有灵敏度高的特点，但是单克隆抗体生产成本高，而且通常需要低温如
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20℃到
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80℃保藏，4℃保藏其中抗体中含有的蛋白酶杂质会将抗体逐渐分解，这使得该技术使用具有很大局限性；采用目测的方法来观察黄龙病的有无是指农户通常通过叶片是否斑驳，有无黄梢等来判断是否有黄龙病，由于叶片的斑驳和黄稍容易和其他柑橘病症或者营养缺素混淆，使该方法对于早期发病的树无法做出准确的判断。
[0005]由于柑橘黄龙病病菌堵塞维管束，并分泌毒性多肽干扰柑橘叶片正常的糖代谢，使得黄龙病病叶中淀粉有异常积累，基于碘淀粉反应的诊断方法进行检测来源于Schneider(1968)发现黄龙病感染的叶片中淀粉含量很高，目前基于碘淀粉反应的诊断方法进行检测包括将叶片剪切成细条状，并在
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4到
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15℃冷冻12
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24小时，进行脱色处理(除去叶绿素，排除叶绿素的影响)，在脱色后的叶片上直接滴加淀粉显色液，用碘对叶片中淀粉进行显色，如果叶片不变色，则为健康叶，如果变蓝色则为黄龙病叶，从而快速诊断黄龙病；该方法操作时间长、不方便，不利于田间的即时检测使用；而且该方法中忽略了淀粉是普遍
存在于柑橘叶片的物质，任何叶片都有淀粉存在，健康的柑橘叶片中也含有淀粉，只是淀粉含量的多少有所不同，健康树叶片的淀粉含量在一定范围内也会和碘发生显色反应，只是显色的深浅和黄龙病树叶片有所不同，而且由于柑橘黄龙病病菌分布的不均匀性，黄龙病病菌在一棵树可能只是在某几个枝条有较高的含量，在另外的枝条含量很少，这可能造成同为黄龙病树的不同枝条间叶片的淀粉含量差异较大；因此采用该方法对凡是显色的叶片进行简单的阳性判定，会出现大量假阳性的现象，导致该方法的检测结果不准确。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒，该试剂盒操作简单且操作所需时间短，滴入碘液后即时检测出结果，利于田间的即时取样检测，具有快速高效简便的特点，而且比色的界限清晰，判定准确，显著提高检测准确率。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的方法，该方法基于比色比较法来对健康树和黄龙病树的叶片淀粉含量进行统计分析，得到更为准确的定量黄龙病淀粉检测方法。
[0008]本专利技术所采用的第一个技术方案是：一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒，包括溶解液、淀粉显色液、比色卡和检测试纸；其中，所述检测试纸为砂纸，所述比色卡包括不同淀粉浓度对应的显色照片。
[0009]优选地，所述溶解液包括醋酸钠
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醋酸缓冲溶液、磷酸二氢钾
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磷酸氢二钾缓冲溶液、磷酸二氢钠
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磷酸氢二钠缓冲溶液和乙醇水溶液中的一种或多种。
[0010]优选地，所述淀粉显色液包括碘酒、碘
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碘化钾溶液和聚乙烯吡咯烷酮碘中的一种或多种。
[0011]优选地，所述比色卡通过以下方法获得：
[0012]称取可溶性淀粉，用溶解液搅拌溶解，分别制成不同淀粉浓度的溶液，向每个浓度的溶液中滴加淀粉显色液进行显色，拍照制成不同淀粉浓度对应的显色照片。
[0013]优选地，所述比色卡通过以下方法获得：
[0014]称取可溶性淀粉，用溶解液搅拌溶解分别制成淀粉浓度为0ppm～6000ppm的溶液，向每个浓度的淀粉溶液中滴加淀粉显色液进行显色，拍照，制成淀粉浓度为0ppm～6000ppm对应的显色照片。
[0015]本专利技术所采用的第二个技术方案是：一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的方法，包括以下步骤：
[0016]步骤1：摘取若干片疑似黄龙病树的叶片，使用同一片检测试纸的磨砂面在每片叶片上摩擦，使叶片的叶肉组织粘附于检测试纸上；
[0017]步骤2：将粘附有叶肉组织的检测试纸置于溶解液中，使得检测试纸上的叶肉组织分散在溶解液中；
[0018]步骤3：向含有叶肉组织的溶解液中滴加淀粉显色液，使溶解液中的叶肉组织与淀粉显色液混合显色；
[0019]步骤4：将步骤3中溶解液的显色与比色卡中不同淀粉浓度对应的显色照片进行对比，得到疑似黄龙病树叶片中的淀粉浓度，若叶片中的淀粉浓度大于或等于淀粉判定边界
值，则判定为阳性；若叶片中的淀粉浓度小于淀粉判定边界值，则判定为阴性。
[0020]优选地，所述步骤1中若干片的叶片为1～5片。
[0021]优选地，所述步骤1包括：使用同一片检测试纸的磨砂面在每片叶片的正面或背面上摩擦10～20次。
[0022]优选地，所述步骤4中淀粉判定边界值为3000ppm。
[0023]上述技术方案的有益效果：
[0024](1)本专利技术公开的一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒操作简单且操作所需时间短，滴入碘液后即时检测出结果，利于田间的即时取样检测，具有快速高效简便的特点，而且比色的界限清晰，判定准确，显著提高检测准确率。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂盒，其特征在于，包括溶解液、淀粉显色液、比色卡和检测试纸；其中，所述检测试纸为砂纸，所述比色卡包括不同淀粉浓度对应的显色照片。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述溶解液包括醋酸钠
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醋酸缓冲溶液、磷酸二氢钾
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磷酸氢二钾缓冲溶液、磷酸二氢钠
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磷酸氢二钠缓冲溶液和乙醇水溶液中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述淀粉显色液包括碘酒、碘
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碘化钾溶液和聚乙烯吡咯烷酮碘中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述比色卡通过以下方法获得：称取可溶性淀粉，用溶解液搅拌溶解，分别制成不同淀粉浓度的溶液，向每个浓度的淀粉溶液中滴加淀粉显色液进行显色，拍照制成不同淀粉浓度对应的显色照片。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述比色卡通过以下方法获得：称取可溶性淀粉，用溶解液搅拌溶解分别制成淀粉浓度为0ppm～6000ppm的溶液，向每个浓度的淀粉溶液中滴加淀粉显色液进行显色，拍照，制成淀...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓方坤，蔡德珍，危云云，欧阳智刚，王希，卢占军，胡珊玲，刘新军，徐梅，占军平，
申请(专利权)人：江西省科学院应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：