一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对白假丝酵母菌的保守区片段扩增的引物组，为引物对CA

【技术实现步骤摘要】
一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]白假丝酵母菌(Candida albicans)是一种真菌，又称白色念珠菌，通常存在于正常人的口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。白色念珠菌在很大一部分人群中作为共生菌存在，无症状地定植于口腔、胃肠道和生殖道。然而，在屏障完整性和/或宿主免疫应答受到干扰时，真菌可通过上皮迁移，并侵入机体细胞并引起疾病。
[0003]目前白假丝酵母菌常用的检测方法主要有生化培养鉴定、血清学检测等。白假丝酵母菌的传统检测方法全过程大约需要5
‑
10d，且检出限极低，费时费力，不能及时、灵敏地检测食品中的致病菌，无法用于处理食物突发事件。与白假丝酵母菌其他检测法相比，PCR方法具有极好的敏感性，但必需经过选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分，一个完整的以PCR为基础的白假丝酵母菌检测法需2d完成。建立一种快速、灵敏、特异的白假丝酵母菌检测方法迫在眉睫。
[0004]基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification of nucleic acids，CDA)是国科宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，CDA还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于白假丝酵母菌的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP中成环引物40bp短，这将极大节省成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。
[0006]本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
[0007]一种非疾病诊断目的的检测白假丝酵母菌的CDA引物组，所述CDA引物组为以下三对引物，
[0008]引物对CA
‑
F2/CA
‑
R2，其中，CA
‑
F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA
‑
R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009]引物对CA
‑
LF/CA
‑
LR，其中，CA
‑
LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CA
‑
LR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0010]引物对CA
‑
MF/CA
‑
MR，其中，CA
‑
MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CA
‑
MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]本专利技术还提供一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的CDA引物组。
[0012]作为优选实施方案，所述CDA引物组中，引物CA
‑
F2与CA
‑
R2的浓度均为0.2～0.4μM，引物CA
‑
LF与CA
‑
LR的浓度均为0.4～1.5μM，引物CA
‑
MF与CA
‑
MR的浓度均为1～2μM。
[0013]作为优选实施方案，所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
[0014]作为优选实施方案，所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。
[0015]作为优选实施方案，所述CDA反应缓冲液包括Tris
‑
HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X
‑
100。
[0016]作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：
[0017]2‑
50mM Tris
‑
HCl pH8.8
[0018]2‑
20mM KCl
[0019]2‑
20mM(NH4)2SO4[0020]2～20mM MgSO4[0021]0.1～0.5％TritonX
‑
100
[0022]0.2～1M甜菜碱
[0023]1～1.6mM dNTP
[0024]5～10U Bst DNA聚合酶
[0025]100～150μmol/L显色剂
[0026]0.2～0.4μM引物CA
‑
F2
[0027]0.2～0.4μM引物CA
‑
R2
[0028]0.4～1.5μM引物CA
‑
LF
[0029]0.4～1.5μM引物CA
‑
LR
[0030]1～2μM引物CA
‑
MF
[0031]1～2μM引物CA
‑
MR；
[0032]反应溶剂为超纯水。
[0033]本专利技术还提供所述的试剂盒非疾病诊断目的的检测白假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：
[0034]步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
[0035]步骤2，上述制得的扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有白假丝酵母菌。
[0036]本专利技术还提供所述的CDA引物组在非疾病诊断目的的白假丝酵母菌检测中的应用。
[0037]本专利技术还提供所述的试剂盒在非疾病诊断目的的白假丝酵母菌检测中的应用。
[0038]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0039]1.本专利技术提供的CDA引物组通过对白假丝酵母菌的特异保守区域(GenBank:
MT193530.1)进行设计并筛选获得，由6条引物组成，包括序列内引物对(CA
‑
MF/CA
‑
MR)、外引物对(CA
‑
F2/CA
‑
R2)、环引物对(CA
‑
LF/CA
‑
LR)。CA
‑
F2/CA
‑
R2分别为上下游外部引物，由F2区组成，并与靶基因的F2c区域互补。本专利技术提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断目的的检测白假丝酵母菌的CDA引物组，其特征在于：所述CDA引物组为以下三对引物，引物对CA
‑
F2/CA
‑
R2，其中，CA
‑
F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA
‑
R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物对CA
‑
LF/CA
‑
LR，其中，CA
‑
LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CA
‑
LR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；引物对CA
‑
MF/CA
‑
MR，其中，CA
‑
MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CA
‑
MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的CDA引物组。3.如权利要求2所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述CDA引物组中，引物CA
‑
F2与CA
‑
R2的浓度均为0.2～0.4μM，引物CA
‑
LF与CA
‑
LR的浓度均为0.4～1.5μM，引物CA
‑
MF与CA
‑
MR的浓度均为1～2μM。4.如权利要求2所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。5.如权利要求4所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自Sybrgreen I、E...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛瑞，蔡昊，蔡挺，桂峥，
申请(专利权)人：中国科学院大学宁波华美医院，
类型：发明
国别省市：