转基因玉米BFL4-2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因玉米BFL4

【技术实现步骤摘要】
转基因玉米BFL4
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法


[0001]本专利技术涉及一种转基因材料的定量检测引物，特别涉及一种转基因玉米BFL4
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物及其检测方法。

技术介绍

[0002]随着转基因作物在全球的种植面积不断扩大，转基因产品的安全性问题引起了世界各国普遍的关注。近年来，关于转基因产品的安全性事件报道不断，尽管有些报道缺乏事实依据，但却更加引起了公众的重视和担忧，而我国尚未建立转基因产品标识制度。
[0003]目前，转基因检测主要有两个大类：一种是在核酸水平上进行检测，另一种是在蛋白质水平上进行检测。在核酸水平上进行检测通常以DNA为模板采用PCR的基础方法进行检测。在应用PCR技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和转化体特异性方法。转化体特异性方法是通过检测外源DNA与染色体连接区的序列来实现的。由于连接区序列的特异性，因而该方法准确性高，最适用于转基因产品检测。
[0004]实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性好和可靠性强的特点，既可以避免定性PCR假阳性现象，又可以对样品中转基因含量进行定量，因而在转基因检测中具有广阔前景。转基因玉米BFL4
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2是由中国农业科学院生物技术研究所研发的抗虫耐除草剂玉米，抗草甘膦、抗鳞翅目昆虫，目前已进入生产性试验阶段，具有极高的产业化应用潜力。迄今为止，国内外还没有用于转基因玉米BFL4
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2定量PCR检测的方法，制定转基因玉米BFL4
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2转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法对于我国转基因生物安全监管、促进我国玉米产业的健康发展具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供用于检测转基因玉米BFL4
‑
2的转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物和探针；所述特异性检测正向引物为：BFL4
‑2‑
qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物为：BFL4
‑2‑
qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
[0006]与其匹配的探针为：BFL4
‑2‑
P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示。
[0007]本专利技术的目的之二是建立一种转基因玉米BFL4
‑
2的转化体特异性实时荧光定量PCR定量方法；
[0008]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009](1)提取待测样品DNA；
[0010](2)以提取的水稻样品的DNA为模板，同时设置玉米内标准基因和转基因玉米BFL4
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR反应体系，对标准梯度样品和待测样品进行检测；
[0011](3)运行实时荧光定量PCR反应，若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明待测样品中不含有转基因玉米BFL4
‑
2品系；
[0012](4)若转化体特异性实时荧光PCR反应体系扩增出荧光信号，则证明样品中含有转基因玉米BFL4
‑
2，根据标准梯度样品读取的荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线Ct＝k
×
Lg(Copies)+b，分别得到一条外源基因标准曲线方程和一条内标准基因标准曲线方程，再将待测样品的Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数，然后按下述公式计算转基因含量：样品中转基因玉米BFL4
‑
2的含量％＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数
×
100。
[0013]BFL4
‑
2水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为：：无菌水8μL，2
×
TaqMan反应缓冲液12.5μL，10μmol/L BFL4
‑2‑
qF1μL，10μmol/L BFL4
‑2‑
qR1μL，10μmol/L BFL4
‑2‑
P0.5μL，DNA模板2μL。
[0014]所述实时荧光定量PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，15s，60℃，60s，40个循环。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术采用实验的方法，对转基因玉米BFL4
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2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物探针进行特异性筛选，并配合使用玉米内标准基因zSSIIb，不仅能够定性检测样品中是否含有转基因玉米BFL4
‑
2，还能定量检测其含量。
附图说明
[0016]图1是引物探针优化扩增曲线图。
[0017]图2是特异性测试扩增曲线图。
[0018]图3是线性区间测试结果：1、标准品S1(20000拷贝)；2、标准品S2(4000拷贝)；3、标准品S3(800拷贝)；4、标准品S4(160拷贝)；5、标准品S5(32拷贝)；6、标准品S6(16拷贝)。
[0019]图4是检出限测试结果。
[0020]图5是内标准基因zSSIIb定量PCR图谱：1、标准品S1；2、标准品S2；3、标准品S3；4、标准品S4；5、标准品S5；6、正确度样品5％；7、正确度样品2％；8、正确度样品0.5％。
[0021]图6是BFL4
‑
2转化体特异性序列定量PCR图谱：1、标准品S1；2、标准品S2；3、标准品S3；4、标准品S4；5、标准品S5；6、正确度样品5％；7、正确度样品2％；8、正确度样品0.5％。
具体实施方式
[0022]下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0023]下述实验采用如下所述的实验材料
[0024]1、植物材料
[0025]转基因玉米BFL4
‑
2纯合体，非转基因玉米郑58，特异性实验验证样品13种。
[0026]特异性实验验证样品设计如下：
[0027]1)阴性对照(郑58)。
[0028]2)阳性对照(转基因玉米BFL4
‑
2，质量分数为1％)。
[0029]3)其他转基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、DAS40278
‑
9、4114、MON87427、5307，含量各1％，以非转基因玉米为填充物)；
[0030]4)转基因大豆混合物(GTS40
‑3‑
2、MON89788、A5547
‑
127、A2704...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因玉米BFL4
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2转化体特异性定量PCR检测引物，其特征在于，所述特异性检测正向引物为：BFL4
‑2‑
qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物为：BFL4
‑2‑
qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的转基因玉米BFL4
‑
2转化体特异性定量PCR检测引物，与其匹配的探针为：BFL4
‑2‑
P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示。3.一种转基因玉米BFL4
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2转化体特异性的定量检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)提取待测样品DNA；(2)以提取的水稻样品的DNA为模板，同时设置玉米内标准基因和转基因玉米BFL4
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2转化体特异性实时荧光定量PCR反应体系，对标准梯度样品和待测样品进行检测；(3)运行实时荧光定量PCR反应，若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明待测样品中不含有转基因玉米BFL4
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2品系；(4)若转化体特异性实时荧光PCR反应体系扩增出荧光信号，则证明样品中含有转基因玉米BFL4
‑
2，根据标准梯度...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗朝华，金芜军，刘卫晓，宛煜嵩，董美，高进，黄卫红，王迪，文婷婷，孟丽霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：