抗体的纯化方法技术

本发明专利技术涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种抗体的纯化方法。抗体的纯化方法，包括如下步骤：待处理抗体样品进行亲和层析提纯、灭活和深层过滤；亲和层析提纯包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，分别采用平衡缓冲液、中间冲洗液和第二平衡缓冲液冲洗，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集。本发明专利技术通过采用一定的亲和层析清洗、洗脱和收集方式，配合一定的深层过滤工艺条件，可显著去除宿主蛋白、DNA以及多聚体等杂质，通过亲和层析和深层过滤配合，达到与现有技术中亲和层析+深层过滤+阴离子交换+阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品收率。提高了产品收率。提高了产品收率。

【技术实现步骤摘要】
抗体的纯化方法


[0001]本专利技术涉及抗体纯化
，尤其是涉及一种抗体的纯化方法。

技术介绍

[0002]单克隆抗体药物通常是利用经基因工程改造的能产生目的蛋白的哺乳动物细胞表达，如CHO、BHK细胞等。哺乳动物细胞培养过程中添加包含多种成分的培养基以及宿主细胞自身产生的宿主蛋白和核酸等，导致细胞培养产物成分复杂。
[0003]抗体药物的下游制备工艺主要包括抗体捕获和精制纯化，抗体经捕获后，仍旧含有DNA、聚集体和宿主蛋白等多种杂质，一般需再经阴离子交换层析和阳离子交换层析处理。也就是目前的抗体纯化中，至少包括三步层析进行蛋白纯化：(1)使用亲和层析进行单抗捕获，去除大部分的宿主蛋白和DNA等杂质；(2)深层过滤后进行阴离子交换层析进一步去除宿主蛋白、DNA以及病毒等杂质；(3)阳离子交换层析用于去除多聚体、电荷异构体等杂质。
[0004]但现有的纯化过程中，步骤较多，成本较高，工艺时间较长，且由于步骤多导致的产品收率较低。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供抗体的纯化方法，以解决现有技术中存在的纯化工艺步骤多、成本高、收率低等技术问题。
[0007]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008]抗体的纯化方法，包括如下步骤：
[0009]待处理抗体样品进行亲和层析提纯、灭活和深层过滤；
[0010]所述亲和层析提纯包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，分别采用所述平衡缓冲液、中间冲洗液和第二平衡缓冲液冲洗，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集；其中，所述平衡缓冲液为50～55mM Tris
‑
HAc，150～160mM NaCl，pH 7.4
±
0.2；所述第二平衡缓冲液为50～55mM NaAc
‑
HAc，pH 5.5
±
0.2；所述中间冲洗液为下述缓冲液中的至少一种：
[0011]缓冲液A：50～55mM NaAc
‑
HAc，1～3M尿素，pH 5.0～5.5；
[0012]缓冲液B：50～55mM NaAc
‑
HAc，0.5％～0.6％Triton，pH 5.5～8.0；
[0013]所述洗脱缓冲液为50～55mM NaAc
‑
HAc，pH 3.5～5.5。
[0014]本专利技术的抗体的纯化方法，通过采用一定的亲和层析清洗、洗脱和收集方式，配合一定的深层过滤工艺条件，可显著去除宿主蛋白、DNA以及多聚体等杂质，将阴离子交换层析和阳离子交换层析的去除作用在亲和层析和深层过滤步骤实现，通过亲和层析和深层过滤配合，达到与现有技术中亲和层析+深层过滤+阴离子交换+阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品收率。
[0015]在本专利技术的具体实施方式中，所述洗脱的方式为梯度洗脱或等度洗脱。进一步的，所述梯度洗脱的程序为：使用梯度洗脱。其中，流动相A可以为50mM NaAc
‑
HAc pH 5.5，流动相B可以为50mM NaAc
‑
HAc pH 3.6，以0％至100％的流动相B进行线性梯度洗脱。
[0016]在本专利技术的具体实施方式中，所述收集包括：当采用等度洗脱时，由紫外值为50～100mAU/2mm@280nm的洗脱液开始收集至紫外值为50～100mAU/2mm@280nm结束收集；当采用梯度洗脱时，由紫外值为50～100mAU/2mm@280nm的洗脱液开始收集至紫外值为500～1000mAu/2mm@280nm结束收集。
[0017]在本专利技术的具体实施方式中，所述亲和层析的填料为MabSelect PrismA。
[0018]在本专利技术的具体实施方式中，在对所述亲和层析柱进行平衡前，还包括对所述亲和层析柱进行消毒。进一步的，所述消毒采用的消毒溶液为0.5～0.6M的NaOH水溶液。
[0019]在本专利技术的具体实施方式中，所述深层过滤的上样条件为：样品pH为5.0～8.5，电导率为5～15mS/cm。
[0020]在本专利技术的具体实施方式中，所述深层过滤的载量为≤2000g/m2。
[0021]采用上述深层过滤工艺配合前述特定的亲和层析提纯处理，能够极大的降低蛋白残留宿主细胞，可从降低至1～2ppm左右，SEC纯度可提高至99％以上，符合最终的质量要求。
[0022]在本专利技术的具体实施方式中，所述深层过滤包括：采用平衡缓冲液平衡深层过滤器，然后上样。进一步的，所述平衡缓冲液为50～55mM Tris
‑
HAc或NaAc
‑
HAc或His
‑
HCl，0～120mM NaCl，pH 5～8，电导率为5～15mS/cm，如可以为50～55mM Tris
‑
HAc，95～100mM NaCl，pH 8.1
±
0.2。
[0023]在实际操作中，在深层过滤中，样品过滤结束后，采用冲洗缓冲液将深层过滤器中的料液置换出。进一步的，所述冲洗缓冲液同所述深层过滤的平衡缓冲液。
[0024]在本专利技术的具体实施方式中，所述深层过滤使用X0HC深层过滤膜(Millistak+HC Pod Depth Filter,X0HC media series)或X0SP深层过滤膜(Millistak+HC Pro Pod Depth Filter,X0SP media series)。
[0025]在本专利技术的具体实施方式中，所述灭活为低pH灭活。进一步的，所述低pH灭活包括：采用醋酸缓冲液调节所述亲和层析提纯收集的洗脱液的pH至3.5～3.7，18～26℃条件下孵育60～90min；然后采用Tris缓冲液调节pH至5.0～8.5。
[0026]在本专利技术的具体实施方式中，所述抗体包括单抗、双抗和融合蛋白中的任一种。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0028](1)本专利技术的抗体的纯化方法，通过采用一定的亲和层析清洗、洗脱和收集方式，配合一定的深层过滤工艺条件，可显著去除宿主蛋白、DNA以及多聚体等杂质，将阴离子交换层析和阳离子交换层析的去除作用在亲和层析和深层过滤步骤实现，通过亲和层析和深层过滤配合，达到与现有技术中亲和层析+深层过滤+阴离子交换+阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品收率；
[0029](2)采用本专利技术的抗体纯化方法，可使SEC纯度达到99％以上，蛋白残留宿主细胞降低至1～2ppm左右，符合最终的质量要求。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗体的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：待处理抗体样品进行亲和层析提纯、灭活和深层过滤；所述亲和层析提纯包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，分别采用所述平衡缓冲液、中间冲洗液和第二平衡缓冲液冲洗，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集；其中，所述平衡缓冲液为50～55mM Tris
‑
HAc，150～160mM NaCl，pH 7.4
±
0.2；所述第二平衡缓冲液为50～55mM NaAc
‑
HAc，pH 5.5
±
0.2；所述中间冲洗液为下述缓冲液中的至少一种：缓冲液A：50～55mM NaAc
‑
HAc，1～3M尿素，pH 5.0～5.5；缓冲液B：50～55mM NaAc
‑
HAc，0.5％～0.6％Triton，pH 5.5～8.0；所述洗脱缓冲液为50～55mM NaAc
‑
HAc，pH 3.5～5.5。2.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述洗脱的方式为梯度洗脱或等度洗脱。3.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述收集包括：当采用等度洗脱时，由紫外值为50～100mAU/2mm@280nm的洗脱液开始收集至紫外值为50～100mAU/2mm@280nm结束收集；当采用梯度洗脱时，由紫外值为50～100mAU/2mm@280nm的洗脱液开始收...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡子健，张赶，杨晓明，叶峰，
申请(专利权)人：苏州创胜医药集团有限公司，
类型：发明
国别省市：