一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法技术

本申请涉及蛋白提取技术领域，具体公开了一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，所述大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，包括配制处理液对大肠杆菌进行预处理后离心，收集获得预处理菌体；利用蔗糖高渗溶液对预处理菌体进行处理后离心，最后用硫酸镁溶液进行处理后离心，即得所需的周质蛋白；上述方法先采用处理液对大肠杆菌的外膜进行干扰，从而使外膜失去完整性，失去了对渗透压的保护作用，再利用高浓度蔗糖溶液造成高渗透压让细胞收缩，最后利用低浓度的硫酸镁处理细胞，从而在保证大肠杆菌内膜完整性的前提下，诱导在细胞周质的蛋白充分释放，显著提高周质蛋白的提取纯度和提取率。显著提高周质蛋白的提取纯度和提取率。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法


[0001]本申请涉及蛋白提取
，更具体地说，它涉及一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法。

技术介绍

[0002]由于大肠杆菌（Escherichiacoli）遗传背景清楚，操作简单，便于进行大规模培养等，因此常用于表达基因工程的重组蛋白，其在医药、农业等行业的应用非常广泛，是大多数科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。细胞周质（Periplasm）是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构，其氧化环境能提供一个适合外源蛋白正确折叠的环境。在大肠杆菌周质空间表达重组蛋白有着众多的优点，由于周质空间的蛋白含量低，蛋白酶活性要比胞质中低，使所表达的目的蛋白能避免胞内降解从而稳定地存在，有利于目的蛋白的浓缩。
[0003]在周质蛋白提取过程中，若内膜破损，会导致胞浆内核酸、脂质以及杂蛋白等物质释放出来，从而给后期目的蛋白的分离纯化带来困难。所以周质蛋白提取需要定向释放的技术，该技术的关键在于只破坏大肠杆菌外膜而不损害内膜，最终使大肠杆菌中内膜和外膜之间的蛋白定向释放至提取液中。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、配制处理液，按含量规格50mL:1g，将大肠杆菌加入到处理液中，于30
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40℃的温度下，静置处理20
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40min，然后置于离心机中离心，弃去上清液，收集剩余菌体，得预处理菌体；S2、按含量规格10mL:1g，取蔗糖高渗溶液和预处理菌体，用蔗糖高渗溶液充分悬浮预处理菌体，并用移液器轻柔吹打10
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20min后，离心弃去上清液，收集剩余菌体，得高渗处理菌体；S3、按含量规格20mL:1g，取2
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7mM的硫酸镁溶液和高渗处理菌体，将硫酸镁溶液预冷至0
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4℃后充分悬浮高渗处理菌体，并在冰上用移液器吹打10
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30min后，离心收集上清液，即得所需的周质蛋白。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中处理液包括10
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20重量份的醋酸溶液、5
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10重量份的壳聚糖和0.5
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1.2重量份的负载纳米银。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述负载纳米银由以下方法制得：避光配制5
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10mM的硝酸银溶液，将羟基磷灰石微粉加入到硝酸银溶液中，超声震荡混合1
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2h后，在3000
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4000rpm下离心10
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20min，收集微粉，去离子水洗涤后，干燥即得所需的负载纳米银。4.根据权利要求2所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中处理液的pH值为3.8
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5.2。5.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中的大肠杆菌由以下方法培养而得：（1）取100μL大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化，取1μL含欲表达蛋白的质粒与融化后的大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴20
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40min后，置于35
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【专利技术属性】
技术研发人员：董晓宁，伍波，邹国英，李勇，吴智广，李超辉，南洋，
申请(专利权)人：天津鸿宇泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：