GLP-1或其变体的羟基化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种GLP

【技术实现步骤摘要】
GLP
‑
1或其变体的羟基化检测方法


[0001]本专利技术涉及多肽检测
，具体涉及一种GLP
‑
1或其变体的羟基化检测方法。

技术介绍

[0002]GLP
‑
1(Glucagon
‑
like peptide 1)是一种由肠道L细胞分泌的多肽类激素，可促进胰岛素的分泌，在血糖调节方面起着重要作用。但由于此多肽在体内极易被DPP
‑
4酶降解，因此该多肽体内半衰期仅为4min左右，因此使用GLP
‑
1作降糖药需要考虑其半衰期。阿必鲁肽是由2个拷贝组成的重组融合蛋白，所述拷贝为30个氨基酸序列的经修饰的人胰高血糖素样肽1(GLP
‑
1，片段7
‑
36(A8G))，其与重组人血清白蛋白连续地基因融合。每个GLP
‑
1序列已被修饰，其中用甘氨酸取代第8位的天然存在的丙氨酸，以赋予对二肽基肽酶IV(DPP
‑
IV)介导的蛋白水解的抗性。阿必鲁肽的血糖调节活性部分由两个串联的GLP
‑
1多肽组成。
[0003]在使用中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary cell,CHO cell)生产含有GLP
‑
1融合蛋白的过程中，GLP
‑
1融合蛋白的GLP
‑
1活性多肽部分被发现第28号位的赖氨酸(Lysine,K)会发生羟基化，且比例不低，如下式所示：<br/>[0004][0005]GLP
‑
1上的赖氨酸发生羟基化修饰会影响产品的最终质量，因此在培养过程中需要对产品的羟基化含量比例进行监控和调节。要监控此位点的翻译后修饰，需要有准确可靠的定量分析方法。由于融合蛋白本身分子量可达70kDa以上，而羟基化的改变仅为16Da，分析上有相当的难度。
[0006]目前主流的翻译后修饰定量分析方法需要借助高分辨率质谱来进行。先对纯化后的样品使用限制性蛋白酶进行酶切，然后使用高效液相色谱进行反相分离，得到良好分离的肽谱图后，然后搜寻含有/未含有翻译后修饰的肽段谱峰的质谱信号进行确证，然后通过公式：羟基化修饰比例％＝(含有羟基化的肽段峰面积)/(含有羟基化的肽段峰面积+未含有羟基化的肽段峰面积)
×
100％计算羟基化的量。
[0007]对于50kDa左右的融合蛋白而言，传统的肽谱图分析会产生相当数量的来自人血清白蛋白HSA部分的肽段谱峰，因此会对数据分析带来困扰，不能满足生产过程中及时监控GLP
‑
1羟基化修饰的需要。

技术实现思路

[0008]基于此，有必要针对上述问题，提供一种GLP
‑
1或其变体的羟基化检测方法，其能
够实现低成本、高检测效率和步骤简化地实现多肽的羟基化水平检测。本专利技术的目的在于提供一种GLP
‑
1或其变体的羟基化检测方法，包括以下步骤：
[0009]将目标分析物GLP
‑
1或其变体与蛋白酶在溶剂中混合，进行酶切反应，得到SEQ ID NO:1所示序列的多肽，所述蛋白酶选自Trypsin酶和Lys
‑
C酶中的任意一种或两种；
[0010]对酶切反应的产物进行液相色谱或液
‑
质谱联用分析；
[0011]其中，GLP
‑
1的变体为在GLP
‑
1的基础上发生氨基酸的增加、缺失或替换后形成的多肽，GLP
‑
1的变体保留有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列的多肽片段，并且在所述GLP
‑
1的变体中，与所述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的多肽片段的C末端相连的第一个氨基酸不为脯氨酸。本专利技术的目的是对GLP
‑
1或其变体中的赖氨酸的羟基化进行检测。通过对GLP
‑
1进行研究，筛选得到两种蛋白酶，Trypsin酶和Lys
‑
C酶，其在合适的酶切条件，如酶的比例、酶切时间和温度下，能够识别XEFIAWLVK序列的多肽片段(Trypsin酶识别的X为K或R，Lys
‑
C酶识别的X为K)，并对其进行酶切，切割得到EFIAWLVK序列的多肽片段。该切割得到的片段含有目标待检测的可能羟基化的赖氨酸，相对于原始长度的GLP
‑
1或其变体，切割后的多肽片段序列缩短，因此以切割后的多肽片段为基准进行检测更精确分辨序列中的赖氨酸是否发生羟基化以及羟基化的比例。本专利技术的方法可应用于监控或检测GLP
‑
1融合蛋白阿必鲁肽和度拉鲁肽的赖氨酸的羟基化水平。并且，本专利技术的检测前的处理方法简单，切割得到EFIAWLVK序列作为检测基准，不含二硫键，只需要测定该小片段，因此不需要进行还原处理，而且筛选得到的两种蛋白酶容易获得，可以节约成本、提高检测效率、简化样品处理步骤。
附图说明
[0012]图1为本专利技术实施例1的阿必鲁肽样品羟基化分析液质分析图；
[0013]图2为本专利技术实施例1的阿必鲁肽样品羟基化分析质谱图；
[0014]图3为本专利技术实施例2的阿必鲁肽样品羟基化分析酶切6小时的样品液相图，色谱峰1代表未羟基化修饰EFIAWLVK片段，色谱峰2代表羟基化修饰EFIAWLVK片段；
[0015]图4为本专利技术实施例2的阿必鲁肽样品羟基化分析酶切6小时的对照液相图；
[0016]图5为本专利技术实施例2的阿必鲁肽样品羟基化分析酶切16小时的样品液相图，色谱峰1代表未羟基化修饰EFIAWLVK片段，色谱峰2代表羟基化修饰EFIAWLVK片段；
[0017]图6为本专利技术实施例3的度拉鲁肽样样品羟基化分析液相图，色谱峰1代表未羟基化修饰EFIAWLVK片段，色谱峰2代表羟基化修饰EFIAWLVK片段。
具体实施方式
[0018]为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相
关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0020]本专利技术实施例提供一种GLP
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1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0021]将目标分析物GLP
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1或其变体与蛋白酶在溶剂中混合，进行酶切反应，得到SEQ ID NO:1所示序列的多肽，所述蛋白酶选自Trypsin酶和L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GLP
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1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将目标分析物GLP
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1或其变体与蛋白酶在溶剂中混合，进行酶切反应，得到SEQ ID NO:1所示序列的多肽，所述蛋白酶选自Trypsin酶和Lys
‑
C酶中的任意一种或两种；对酶切反应的产物进行液相色谱或液
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质谱联用分析；其中，GLP
‑
1的变体为在GLP
‑
1的基础上发生氨基酸的增加、缺失或替换后形成的多肽，GLP
‑
1的变体保留有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列的多肽片段，并且在所述GLP
‑
1的变体中，与所述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的多肽片段的C末端相连的第一个氨基酸不为脯氨酸。2.根据权利要求1所述的GLP
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1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，所述蛋白酶与所述目标分析物的质量比为1：(20～200)，所述酶切反应的温度为15℃～30℃，所述酶切反应的时间为2h～20h。3.根据权利要求1所述的GLP
‑
1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，所述蛋白酶与所述目标分析物的质量比为1：(20～100)。4.根据权利要求3所述的GLP
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1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，所述酶切反应的时间为2h～6h。5.根据权利要求1所述的GLP
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1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，所述目标分析物与所述蛋白酶混合之前，还包括将目标分析物进行换液，调节得到的换液后溶液的pH值至7～9的步骤。6.根据权利要求1～5任一项所述的GLP
‑
1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，所述GLP
‑
1的变体具有如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的多肽片段，并且在所述GLP
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1的变体中，与所述SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的多肽片段的C末端相连的第一个氨基酸不为脯氨酸。7.根据权利要求1～5任一项所述的GLP
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1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，所述GLP
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1的变体为阿必鲁肽或度拉鲁肽。8.根据权利要求7所述的GLP
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1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，所述GLP
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1的变体为阿必鲁肽，所述液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为甲酸乙腈溶液，所述流动相A中甲酸的体积百分数为0.1％～1％，所述流动相B中甲酸的体积百分数为0.1％～1％；所述液相色谱采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序为：0～35min，所述流动相A的体积分数随时间增加由100％减小为40％；35min～40min，所述流动相A的体积分数随时间增加由40％减小为0；40min～50min，所述流动相A的体积分数为0；50min～50.1min，所述流动相A的体积分数...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮路，景涛，李瑶，陆艳，
申请(专利权)人：广州汉腾生物科技有限公司佛山普津生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：