本发明专利技术提供了猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用，本发明专利技术属于生物技术领域。该构建方法包括：以猪流行性腹泻病毒的基因组RNA反转录产物为模板，扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7片段；基于酵母内同源重组机制，将线性化的pYES1L载体和F1～F7片段混合、转化如酵母感受态细胞，从而实现病毒cDNA片段与原载体的一步无缝连接得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将病毒ORF3编码区替换成绿色荧光蛋白基因，构建表达绿色荧光蛋白的重组猪流行性腹泻病毒。本发明专利技术所述方法快速简便、成功率高，可用于拯救猪流行性腹泻病毒及其它冠状病毒，为研究该病毒的复制机制、致病机理以及开发新型疫苗提供可靠的技术平台。型疫苗提供可靠的技术平台。型疫苗提供可靠的技术平台。
【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆及其构建方法与应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用。
技术介绍
[0002]猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的一种急性和高度传染性的猪肠道疾病，临床症状与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)相似，其特征是呕吐、腹泻和厌食，最后因消瘦和严重脱水死亡。各年龄段均可感染，其中仔猪感染后的临床症状尤为严重，死亡率接近100％。除了感染哺乳仔猪，PEDV还可降低育肥猪的生长性能。近年来，高致病性PEDV变异毒株的出现和广泛传播给养猪业造成了巨大的经济损失。除生物安全防控外，疫苗接种是防控猪流行性腹泻最有效的方法。但是，目前商品化的疫苗提供的保护有限，研制新一代疫苗仍然迫在眉睫。PEDV归属于套式病毒目、冠状病毒亚科、甲型冠状病毒属。它是一种囊膜包裹的单股正链RNA病毒，其全长基因组约28kb，包括5
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端帽子结构和非编码区，3
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端非编码区和poly(A)尾巴，以及7个开放阅读框(ORFs)，包括ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M和N基因。5
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端的ORF1a和ORF1b编码的两个多聚蛋白(pp1a和pp1ab)，3
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端的5个ORF依次编码纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、小包膜糖蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。有研究表明，ORF3为PEDV复制非必需元件，可被替换用于表达外源基因。
[0003]反向遗传操作系统是一种定向改造和修饰病毒基因组的重要基因工程技术，该技术已成为病毒学基础研究和疫苗研发必不可少的技术平台。目前，PEDV反向遗传操作系统主要包括以下三种：基于靶向RNA重组的技术、基于细菌人工染色体的感染性cDNA克隆、基于体外连接的感染性cDNA克隆等。根据病毒拯救方式不同，PEDV反向遗传操作系统又可以分为RNA转染和DNA转染两类系统。为简化PEDV感染性cDNA克隆的构建过程，本专利技术以基因II型的PEDV HM毒株为亲本株，基于酵母转化同源重组技术(Transformation Associated Recombination，TAR)构建了CMV启动的猪流行性腹泻病毒的反向遗传操作平台，并借助CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了表达绿色荧光蛋白的PEDV标记病毒。本专利技术为PEDV致病机制及其基因工程疫苗研制奠定了基础。
技术实现思路
[0004]专利技术目的：本专利技术需要解决的技术问题是提供一种猪流行性腹泻病毒的感染性cDNA克隆的构建方法，该构建方法简便、稳定好、效率高，该感染性克隆拯救的病毒rPEDV和rPEDV
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EGFP感染Vero CCL
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81细胞后能够引起细胞病变，生长特性与亲本病毒基本一致，且保持遗传稳定。
[0005]技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法，包括如下步骤：
[0007](1)以猪流行性腹泻病毒的cDNA为模板、SEQ ID NO.：1～14所示的序列为引物，将
猪流行性腹泻病毒生物基因组分为7个片段扩增出来；
[0008](2)以pYES1L
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vector为模板、SEQ ID NO.：15～16所示的序列为引物，扩增得到线性化载体pYES1L，所述pYES1L
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vector的核苷酸序列如SEQ ID NO.：18所示；
[0009](3)将线性化载体pYES1L与步骤(1)得到的7个基因组片段混和，加入到MaV203酵母感受态中，利用醋酸锂转化法转化至酵母细胞，接种于色氨酸(Trp)缺陷型平板上，经菌落PCR法筛选出阳性克隆，将阳性克隆的酵母裂解液转化DH10B电击感受态，获得重组质粒，即猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。
[0010]作为优选，所述猪流行性腹泻病毒的基因组序列如SEQ ID NO.：17所示。
[0011]上述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法构建得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。
[0012]基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法，包括以下步骤：
[0013](4)以EGFP基因为模板，以SEQ ID NO.：19～20所示的序列为引物进行PCR扩增，得到EGFP基因片段；
[0014](5)用Cas9 Nuclease和两条guide RNA切割权利要求1得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆，所述guide RNA的序列如SEQ ID NO.：21～22所示，得到缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架；
[0015](6)将EGFP和缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架片段混合，进行体外同源重组，转化至DH10B电击感受态中，获得重组质粒，即表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒。
[0016]上述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法构建得到的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒在本专利技术的保护范围之内。
[0017]上述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆或表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒在拯救病毒中的应用。
[0018]进一步地，利用转染试剂Lipofectamine
TM 3000将权利要3猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆和辅助质粒共转染VeroCCL
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81细胞，当出现典型细胞病变收取病毒上清，获得拯救的rPEDV。
[0019]作为优选，所述辅助质粒的构建方法如下：以猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆为模板、SEQ ID NO.17～18为引物，PCR扩增得到N基因片段，N基因片段插入到pCAGGS载体的SacI和XhoI位点之间，得到辅助质粒。
[0020]下面以猪流行性腹泻病毒HM株为例对本专利技术的方法进行进一步说明。
[0021]猪流行性腹泻病毒HM株感染性cDNA克隆构建方法，包括以下步骤：
[0022](1)以pYES1L载体为模板，用引物pYES1L
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F和pYES1L
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R进行PCR扩增，得到线性化的pYES1L载体；
[0023](2)以猪流行性腹泻病毒HM株的病毒RNA的反转录产物为模板，用引物PEDV
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F1和PEDV
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R1扩增F1片段，用引物PEDV
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F2和PEDV
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R2扩增F2片段，用引物PEDV
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F3和R3扩增F3片段，用引物PED本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以猪流行性腹泻病毒的cDNA为模板、SEQ ID NO.：1～14所示的序列为引物，将猪流行性腹泻病毒生物基因组分为7个片段扩增出来；(2)以pYES1L
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vector为模板、SEQ ID NO.：15～16所示的序列为引物，扩增得到线性化载体pYES1L，所述pYES1L
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vector的核苷酸序列如SEQ ID NO.：23所示；(3)将线性化载体pYES1L与步骤(1)得到的7个基因组片段混和，加入到MaV203酵母感受态中，利用醋酸锂转化法转化至酵母细胞，接种于色氨酸(Trp)缺陷型平板上，经菌落PCR法筛选出阳性克隆，将阳性克隆的酵母裂解液转化DH10B电击感受态，获得重组质粒，即猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒的基因组序列如SEQ ID NO.：24所示。3.权利要求1～2任一所述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法构建得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。4.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法，包括以下步骤：(1)以EGFP基因为模板，以SEQ ID NO.：19～20所示的序列为引物进行PCR扩增，得到EGFP基因片段；(2)用Cas9 Nuclease和两条guide RNA切割权利要求1得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：李燕华，周弇扬，李晨曦，任次成，胡晶博，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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