副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂及其制备方法和应用，它的各组分重量百分比为：蔗糖：2％～8％，甘露醇：0.5％～4％，聚乙烯吡咯烷酮：0.25％～3％，右旋糖酐：2％～6％，余量为超纯水。该方法将聚乙烯吡咯烷酮和右旋糖酐溶于一部分的水中，高温灭菌得到溶液A；然后将蔗糖和甘露醇溶于剩余的水中，过滤除菌得到溶液B；最后将溶液A和溶液B混合均匀得到冻干保护剂。本发明专利技术的冻干保护剂生产成本较低，且不含动物源成分，降低了不良反应的发生。另外，该保护剂冻干的副猪嗜血杆菌活疫苗，具有良好的耐热能力和储存稳定性。具有良好的耐热能力和储存稳定性。具有良好的耐热能力和储存稳定性。

【技术实现步骤摘要】
副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物保存
，具体涉及一种副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]副猪嗜血杆菌作为一种定植于猪上呼吸道的条件性致病菌，可导致猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，对养猪业造成重大的经济损失(Brockmeier SL,Loving CL,Mullins MA,Register KB,Nicholson TL,Wiseman BS,Baker RB,Kehrli ME Jr.Virulence,transmission,and heterologous protection of four isolates of Haemophilus parasuis[J].Clin Vaccine Immunol,2013,20:1466
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1472)。弱毒活疫苗接种作为传染病防控的重要手段，其不仅成本相对较低，而且可以刺激机体产生更加全面的免疫应答(Liu H,Xue Q,Zeng Q,Zhao Z.Haemophilus parasuis vaccines[J].Vet Immunol Immunopathol,2016,180:53
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58)。但是，活疫苗的稳定性相对较差，极大受控于外界条件的影响，很容易在运输和储存期间失去保护效力(Price DN,Kunda NK,Ellis R,Muttil P.Design and optimization of a temperature
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stable dry powder BCG vaccine[J].Pharm Res,2019,37:11)。因此，稳定性成为活疫苗商品化的重要指标。
[0003]冷冻干燥作为一种常用的微生物保存技术，其不仅可以延长制品保存时间，还可以降低运输成本以及储存条件要求，被广泛运用于兽用活疫苗研制(Hansen LJJ,Daoussi R,Vervaet C,Remon JP,De Beer TRM.Freeze
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drying of live virus vaccines:A review[J].Vaccine,2015,33:5507
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5519)。然而，冻结和干燥所产生的相关应力往往会导致细胞活性下降甚至死亡，进而影响免疫效果，因此，冷冻干燥过程中需添加合适的冻干保护剂来减少细胞损伤(Friess W,Winter G.Meeting the challenges in freeze
‑
drying of pharmaceuticals and biologicals[J].Eur J Pharm Biopharm,2013,85:161)。
[0004]根据物质性质，冻干保护剂成分可分为糖类、醇类、氨基酸、大分子聚合物等几种类型，每种类型又包括多种具体物质(Izutsu KI.Applications of freezing and freeze
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drying in pharmaceutical formulations[J].Adv Exp Med Biol,2018,1081:371
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383)，例如：
[0005]1)糖类包括蔗糖、海藻糖、乳糖等。
[0006]2)醇类包括山梨醇、甘露醇、甘油等。
[0007]3)氨基酸包括精氨酸、谷氨酸、甘氨酸等。
[0008]4)大分子聚合物包括右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、2
‑
羟丙基
‑
β
‑
环糊精等。
[0009]由于不同保护剂的保护机制各不相同，单一成分并不能满足微生物抵抗恶劣环境的需求，冻干保护剂往往需多种成分配伍组合。
[0010]目前，针对副猪嗜血杆菌冻干保护剂的研究，相关文献仅本专利技术人所在实验室公开了一种具体配方成分(秦胚.副猪嗜血杆菌冻干保护剂的筛选与优化.[硕士学位论文].
武汉：华中农业大学图书馆，2015)，即脱脂奶9.12％，海藻糖2.87％，甘油2.96％，其冻干存活率为60.30％；然而该保护剂存在以下问题：
[0011]1)该保护剂含有较大比例的动物源物质，即脱脂奶粉，可作为致敏原引起动物发生不良反应。
[0012]2)其次，该保护剂含有较大比例的海藻糖，大大增加了生产成本。

技术实现思路

[0013]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂及其制备方法和应用，该保护剂不含有动物源物质，且生产成本较低。另外，使用该疫苗冻干的副猪嗜血杆菌活疫苗，具有良好的耐热能力。
[0014]为实现上述目的，本专利技术所设计一种副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂，所述冻干保护剂的各组分重量百分比为：蔗糖：2％～8％，甘露醇：0.5％～4％，聚乙烯吡咯烷酮：0.25％～3％，右旋糖酐：2％～6％，余量为超纯水。
[0015]进一步地，所述冻干保护剂的各组分重量百分比为：蔗糖：2％～4％，甘露醇：1％～2％，聚乙烯吡咯烷酮：0.25％～1％，右旋糖酐：2％～4％，余量为超纯水。
[0016]再进一步地，所述冻干保护剂的各组分重量百分比为：蔗糖：2％，甘露醇：2％，聚乙烯吡咯烷酮：0.5％，右旋糖酐：3％和超纯水：92.5％。
[0017]本专利技术还提供了一种上述副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0018]1)按上述体积重量比称取蔗糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐和超纯水；
[0019]2)将聚乙烯吡咯烷酮和右旋糖酐溶于一部分的水中，高温灭菌得到溶液A；
[0020]3)将蔗糖和甘露醇溶于剩余的水中，过滤除菌得到溶液B；
[0021]4)将溶液A和溶液B混合均匀得到冻干保护剂。
[0022]进一步地，所述步骤2)中，高温灭菌温度为110～121℃；时间为10～30min；
[0023]所述步骤3)中，过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。
[0024]本专利技术还提供了一种上述的冻干保护剂在制备副猪嗜血杆菌无动物源冻干活疫苗制品中的应用。
[0025]本专利技术还提供了一种副猪嗜血杆菌无动物源冻干活疫苗制品的制备方法，将上述的冻干保护剂与副猪嗜血杆菌菌液按体积比2～4:1进行混合，冻干得到疫苗制品。
[0026]进一步地，所述副猪嗜血杆菌菌液由以下方法培养而成：
[0027]1)冷冻保藏的冻干副猪嗜血杆菌种用TSA培养基(添加血清和NAD)复苏活化；
[0028]2)将挑取单菌落接种于TSB液体培养基中培养，继续扩大培养；选取对数末期菌液进行离心再重悬；即得到副猪嗜血杆菌菌液，其中，副猪嗜血杆菌菌液中活菌数为9～15
×
109CFU/mL。
[0029]再进一步地，所述冻干的程序为：
[0030]首先将混合物置于温度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂，其特征在于：所述冻干保护剂的各组分重量百分比为：蔗糖：2％～8％，甘露醇：0.5％～4％，聚乙烯吡咯烷酮：0.25％～3％，右旋糖酐：2％～6％，余量为超纯水。2.根据权利要求1所述副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂，其特征在于：所述冻干保护剂的各组分重量百分比为：蔗糖：2％～4％，甘露醇：1％～2％，聚乙烯吡咯烷酮：0.25％～1％，右旋糖酐：2％～4％，余量为超纯水。3.根据权利要求1或2所述副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂，其特征在于：所述冻干保护剂的各组分重量百分比为：蔗糖：2％，甘露醇：2％，聚乙烯吡咯烷酮：0.5％，右旋糖酐：3％和超纯水：92.5％。4.一种权利要求1～3任意一项所述副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)按上述体积重量比称取蔗糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐和超纯水；2)将聚乙烯吡咯烷酮和右旋糖酐溶于一部分的水中，高温灭菌得到溶液A；3)将蔗糖和甘露醇溶于剩余的水中，过滤除菌得到溶液B；4)将溶液A和溶液B混合均匀得到冻干保护剂。5.根据权利要求4所述副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，高温灭菌温度为110～121℃；时间为10～30min；所述步骤3)中，过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。6.一种权利要求1～2所述的冻干保护剂在制备副猪嗜血杆菌无动物源冻干活疫苗制品中的应用。7.一种副猪嗜血杆菌无动物源冻干活疫苗制品的制备方法，其特征在于：将权利要求1～3中任意一种所述的冻干保护剂与副猪嗜血杆菌菌液按体积比2～4:1进行混合，冻干得...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡旭旺，蔡国华，刘世强，戴昕燕，张迪，冯师帆，林燕，王智超，顾嘉运，徐晓娟，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：