一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物及其制备方法技术

本发明专利技术属于菌种保藏领域，具体涉及一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物及其制备方法。该保藏组合物由重组大肠杆菌菌种和复合物组分组成，所述复合物组分包含冻干保护剂、磷酸盐缓冲盐或纯化水。该组合物性状稳定，制备方法简单，保藏时间长，保藏后的菌种经复壮后，外源质粒易丢失显著下降，菌种活率经长期保藏后仍可有效保持。可有效保持。

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物及其制备方法


[0001]本专利技术属于菌种保藏领域，具体涉及一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物及其制备方法。

技术介绍

[0002]菌种保藏就是人工创造条件使菌种处于与外界空气隔绝的状态。菌种保藏的原理是使微生物的代谢尽量降低，以减少变异，一般可通过限制营养、缺氧、干燥、高温和低温等各种方式，使菌种处于“半休眠”或“休眠”状态，减少菌种的变异几率和死亡概率，并保持良好的遗传基因。
[0003]重组大肠杆菌为一种基因工程菌，含有由载体质粒等携带的外源DNA片段，这些片段通常具有遗传不稳定性，在传代过程中很容易丢失其外源质粒复制子，在菌种保藏和复壮阶段也很容易因丢失外源质粒而直接影响基因工程菌种的相关性能。重组大肠杆菌的菌种保藏通常采用甘油管
‑
80℃超低温或液氮保藏的方式，甘油管
‑
80℃超低温保藏的设备费用较高，一般基层单位难以达到，保存一段时间后菌种活率显著降低；液氮保藏的保存条件要求苛刻，不仅保藏初始费用较高，保藏过程中因液氮蒸发导致温度上升，冰晶状态发生变化而容易导致菌种死亡，所以需频繁、密切关注液氮残存量，定期补加液氮，在补加时还存在因液氮暴露在空气中会发生爆炸的危险，操作人员需具备较高的操作熟练度。
[0004]CN106867905A公开了一种用于菌种保藏的保藏液及重组大肠杆菌的高密度发酵方法，工作菌种库在4至10℃条件下保藏332天，菌种存活率为81.2％以上，保藏538天的存活率在74.8％以上，该菌种保藏的方法适用于日常实验用菌种取用，此外，由于保藏液中富含多种营养物质，使得菌种在4～10℃时仍会进行缓慢的生长代谢，容易导致保护剂变质腐败，更不利于菌种的长期保藏。
[0005]CN109294917A公开了一种菌种保藏剂及利用该保藏剂超低温冷冻保藏基因工程菌的方法。保藏液中添加了抗生素，用于抑制微生物，提供有利的生长选择压，并抑制保护基变质，但该保藏方法仍需要
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80℃超低温条件，且保藏液中添加抗生素，不利于菌种长期(5年以上)保存的活率保持，例如一株高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌应用此专利技术菌种保藏剂和保藏方法在
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80℃保藏1年后，复壮的菌株发酵生产丙酮酸的产量较保藏前已下降了5％。
[0006]为克服以上问题，需要研究开发新的菌种保藏方法，专利技术人尝试使用冷冻干燥的方法保藏重组大肠杆菌菌种，然而冻干过程是一个复杂的相变过程，在冻结、冻融、干燥和储存过程中，存在着多种诱导菌种死亡、外源质粒丢失、菌种活率下降的因素，此外，菌种悬液的浓度、冻干菌种材料的菌龄、培养基的种类、保护剂等较多因素也会影响菌种的冷冻保藏，因此需根据菌种的特性选择适宜的冻干条件，选择合适种类及数量的冻干保护剂，才能保证菌种的长期稳定存储与生产应用。
[0007]因此，研究开发出一种适用于重组大肠杆菌菌种保藏的操作方法简单、条件温和、并可保证菌种性能稳定、实现长期保存的保藏方法，对于基因工程菌优良性能的保持、复制
和延续具有重大的现实意义，更有利于工业化稳定生产。

技术实现思路

[0008]鉴于现有技术中，即使使用低温保护剂或采用超低温保藏，重组大肠杆菌菌种在保藏或复壮过程中，外源质粒易丢失、菌种活率经长期保藏后下降显著、保藏方法的操作繁琐等不足，本申请通过研究，得到了一种适用于重组大肠杆菌菌种长期保藏的冻干组合物及其制备方法。以使性能优良的重组大肠杆菌菌种通过本专利技术的冻干组合物和方法保藏后，质粒丢失率下降、存活率和菌体活性均能得到有效保持。
[0009]本专利技术的技术方案为：一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物，所述组合物由重组大肠杆菌菌种和复合物成分组成，所述复合物成分包含冻干保护剂，以及磷酸盐缓冲盐或纯化水。
[0010]经实验，多数大肠杆菌菌种均可使用本专利技术的方法，优选地，所述重组大肠杆菌菌种为聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子工程菌(P
ET
‑
rhG
‑
CSF
/BL
21
(DE3)PlysS)、重组甘精胰岛素工程菌(P
ET
‑
Glargine
/BL
21
(DE3)PlysS)或TNHH工程菌(P
ET
‑
TNHH
/BL
21
(DE3)PlysS)。
[0011]进一步优选地，所述重组大肠杆菌菌种为聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子工程菌(P
ET
‑
rhG
‑
CSF
/BL
21
(DE3)PlysS)，所述工程菌的序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
[0012]优选地，在制备所述重组大肠杆菌菌种时，在菌液密度OD
600
达到1.0～1.5时，使用磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液调节菌液的pH值为5.0～6.0，继续摇瓶培养。
[0013]优选地，所述重组大肠杆菌菌种的菌液最终OD
600
值为2～3；进一步优选为2.2～2.6。
[0014]优选地，所述组合物中，复合物成分的使用体积为重组大肠杆菌菌种的种子液体积的0.2～0.8倍，进一步优选为0.3～0.6倍。
[0015]优选地，所述组合物中，冻干保护剂选自脱脂奶粉、甘氨酸和甘露醇中的一种或几种。
[0016]优选地，所述组合物中，复合物中的冻干保护剂的质量体积浓度为5～25％，即每100mL溶剂中含有5～25g冻干保护剂；进一步优选为5～15％。
[0017]优选地，所述组合物中，复合物成分还可以包含聚糖。
[0018]进一步优选地，所述聚糖选自乳糖、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。
[0019]优选地，所述组合物中，复合物成分中的聚糖的质量体积浓度为0～35％，即每100mL溶剂中含有0～35g聚糖；进一步优选为聚糖的质量体积浓度为10～20％。
[0020]优选地，所述组合物中，磷酸盐缓冲盐的浓度为10～50mM。
[0021]优选地，所述组合物中，磷酸盐缓冲盐的pH值为6.5～7.5；进一步优选地，pH值为6.8～7.2。
[0022]在一个优选的实施方式中，一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物，由重组大肠杆菌菌种和复合物成分组成，其中，重组大肠杆菌菌种的种子液体积与复合物成分的体积比1:0.2～0.8，复合物成分由质量体积浓度为5～25％的冻干保护剂、质量体积浓度为0～35％的聚糖，与磷酸盐缓冲盐或纯化水混合，定容而得；进一步优选地，所述组合物中，磷酸盐缓冲盐的浓度为10～50mM；更为优选地，所述组合物中，磷酸盐缓冲盐的pH值为6.8～
7.2。
[0023]本专利技术的第二方面，提供了一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物的制备方法：将重组大肠杆菌菌种与组合物中的复合物成分混合，分装冻干管后进行冷冻干燥处理。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌菌种的冻干组合物，其特征在于，所述组合物由重组大肠杆菌菌种和复合物成分组成，所述复合物成分包含冻干保护剂，以及磷酸盐缓冲盐或纯化水。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组大肠杆菌菌种为聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子工程菌、重组甘精胰岛素工程菌或TNHH工程菌；优选地，所述重组大肠杆菌菌种为聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子工程菌。3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述冻干保护剂选自脱脂奶粉、甘氨酸和甘露醇中的一种或几种。4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复合物成分中，冻干保护剂的质量体积浓度为5～25％，即每100mL溶剂中含有5～25g冻干保护剂。5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，复合物成分还可以包含聚糖，优选地，聚糖选自乳糖、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述复合物成分中，聚糖的质量体积浓度为0～35％，即每100mL溶剂中含有0～35g聚糖。7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，在制备所述重组大肠杆菌菌种时，在菌液密度OD
600
达到1.0～1.5时，使用磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液调节菌液的pH为5.0～6.0，继续摇瓶培养。8.一种如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将重组大肠杆菌菌种与组合物中的复合物成分混合，分装冻干管后进行冷冻干燥处理。9.如权利要求8所述的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘忠，冀成法，
申请(专利权)人：山东新时代药业有限公司，
类型：发明
国别省市：