一种硬葡聚糖组合保护剂在放线菌冷冻干燥保藏中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂、制备方法及其在难保藏放线菌方面的应用。该菌种保藏剂由以下质量体积比的成分组成：脱脂牛奶10%

【技术实现步骤摘要】
一种硬葡聚糖组合保护剂在放线菌冷冻干燥保藏中的应用


[0001]该专利技术属于菌种保藏
，尤其涉及一种含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂、制备方法及其在难保藏菌种方面的应用。

技术介绍

[0002]菌种保藏为一切微生物工作的基础，一个好的菌种保藏方法是获得优良菌种的保证。目前常用的菌种保藏方法包括冷冻干燥保藏法、超低温冰箱保藏法、液氮保藏法、传代培养保藏法，载体保藏法等，这些方法主要根据不同微生物的生理生化特点，人为创造缺氧、低温或干燥的条件，以降低微生物新陈代谢速度，使其不发生变异的同时又能够保持生活能力，保证菌种在保藏后仍保持其原有的生命活力、形态特征和优良性状，其中冷冻干燥保藏法是公认的菌种保藏最有效方法之一。
[0003]菌种冷冻干燥保藏法是用菌种保藏剂制备待保藏菌种悬液于安瓿管中，预先降温冻结成固体后，在真空减压条件下将其水分升华去除的方法。该方法使得菌种在非剧烈，非直接损伤状态下处于干燥、缺氧状态，以实现其长期稳定保存。在使用冷冻干燥法保藏菌种的过程中，菌种保藏剂是提高菌种冷冻干燥保藏存活率并延长菌种保藏期的关键因素。
[0004]在科研及生产过程中，一些菌种由于自身特性在利用常规冷冻干燥方法进行保藏后，其存活率和稳定性均无法达到理想水平，为不易保藏菌种，无法对其进行长期有效稳定保藏，为菌种保藏工作所面临的一大难题。

技术实现思路

[0005]为解决不易保藏菌种在冷冻干燥保藏后存活率较低的问题，本专利技术提供一种含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂、制备方法及其在难保藏菌种方面的应用。
[0006]本专利技术首先提供了一种含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂，由以下质量体积比的成分组成：脱脂牛奶10%-20%和硬葡聚糖0.1%-0.5%，以蒸馏水配制。
[0007]本专利技术还提供了所述菌种保藏剂的制备方法：分别配制质量百分比的脱脂牛奶和硬葡聚糖的水溶液，经115℃高压蒸汽灭菌20min，待其温度降至40~60℃范围内，在无菌条件下按照体积比1：1混合均匀，得到冷冻干燥菌种保藏剂。
[0008]本专利技术还提供了一种应用本专利技术所述含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂于难保藏菌种的方法，包括步骤如下：（1）在无菌条件下，将5~30 mL菌种冷冻干燥保藏剂加入待保藏菌种培养成熟的茄子瓶斜面中，并用无菌接种针刮取斜面上层孢子，制得单孢子悬液。
[0009]（2）将步骤（1）得到的待保藏单孢子悬液以0.5~1.0mL装量分装入无菌安瓿管中，降温至-80℃预冻。
[0010]（3）将步骤（2）中安瓿管立即放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，之后在真空状态下用酒精喷灯对安瓿管进行熔封，检验合格后在低温环境下长期保藏。
[0011]进一步的，步骤（2）中预冻降温采用逐级降温方式，首先4℃保持30min~60min，然
后迅速转到-20℃保持1h~2h，最后-80℃保持4~6h。
[0012]进一步的，步骤（3）中真空干燥时间为8~10 h，冻干后含水量控制在1~3%，低温保藏温度是2~8℃。
[0013]本专利技术具有的积极效果：本专利技术利用现有的真空冷冻干燥设备，保藏方法操作简便，保藏效果稳定，最大限度降低菌种在冷冻干燥过程所产生的失水损伤，大大提高了难保藏菌种的长期保藏存活率。
[0014]具体实施例：以下实施例用于说明本专利技术，但是这些实施例不用来限制本专利技术的范围。实施例中的去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌和雷帕霉素产生菌吸水链霉菌由华北制药集团新药研发公司提供。
[0015]实施例1配制含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂：分别配制质量体积比20%脱脂牛奶和1%硬葡聚糖的蒸馏水溶液，经115℃高压蒸汽灭菌20 min，待其温度降至40~60℃范围内，在无菌条件下按照体积比按1：1混合均匀，得到冷冻干燥菌种保藏剂。
[0016]应用所配制的含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂于去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌的方法，包括以下步骤：（1）在无菌条件下，将15 mL菌种冷冻干燥保藏剂加入去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌培养成熟的茄子瓶斜面中，并用无菌接种针刮取斜面上层孢子，得单孢子悬液。
[0017]（2）将步骤（1）得到的单孢子悬液以0.5 mL装量分装入无菌安瓿管中，采用逐级降温方式，首先4℃60min，然后迅速转到-20℃1h，最后-80℃6h。
[0018]（3）将步骤（2）中安瓿管立即放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理8h，冻干后含水量控制在1~3%，之后在真空状态下用酒精喷灯对安瓿管进行熔封，检验合格后在2~8℃低温环境下长期保藏。
[0019]（4）测定制备存活率，将制备好的冻存管于2~8℃分别保藏3个月、6个月和1年之后，采用活计数法对其存活率进行测定。经活计数测定，去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌3个月存活率为63.5%，6个月存活率为63.7%，1年存活率为62.8%。
[0020]实施例2配制含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂：分别配制质量体积比30%脱脂牛奶和0.4%硬葡聚糖的蒸馏水溶液，经115℃高压蒸汽灭菌20 min，待其温度降至40~60℃范围内，在无菌条件下按照体积比按1：1混合均匀，得到冷冻干燥菌种保藏剂。
[0021]应用所配制的含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂于去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌的方法，包括以下步骤：（1）在无菌条件下，将30 mL菌种冷冻干燥保藏剂加入去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌培养成熟的茄子瓶斜面中，并用无菌接种针刮取斜面上层孢子，得单孢子悬液。
[0022]（2）将步骤（1）得到的单孢子悬液以1 mL装量分装入无菌安瓿管中，采用逐级降温方式，首先4℃30min，然后迅速转到-20℃2h，最后-80℃4h。
[0023]（3）将步骤（2）中安瓿管立即放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理10 h，冻干后含水量控制在1~3%，之后在真空状态下用酒精喷灯对安瓿管进行熔封，检验合格后在2~8℃低温环境下长期保藏。
[0024]（4）测定制备存活率，并将制备好的冻存管于2~8℃分别保藏3个月、6个月和1年之后，采用活计数法对其存活率进行测定。经活计数测定去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌3个月存活率为51.2%，6个月存活率为52.3%，1年存活率为51.8%。
[0025]实施例3配制含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂：分别配制质量体积比40%脱脂牛奶和0.2%硬葡聚糖的蒸馏水溶液，经115℃高压蒸汽灭菌20 min，待其温度降至40~60℃范围内，在无菌条件下按照体积比按1：1混合均匀，得到冷冻干燥菌种保藏剂。
[0026]应用所配制的含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂于去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌的方法，包括以下步骤：（1）在无菌条件下，将5 mL菌种冷冻干燥保藏剂加入去甲万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌培养成熟的茄子瓶斜面中，并用无菌接种针刮取斜面上层孢子，得单孢子悬液。
[0027]（2）将步骤（1）得到的单孢子悬液以0.5 mL装量分装入无菌安瓿管中，采用逐级本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含硬葡聚糖冷冻干燥菌种保藏剂，其特征在于：该保藏剂由以下质量体积比的成分组成：脱脂牛奶10%-20%和硬葡聚糖0.1%-0.5%，以蒸馏水配制。2.一种如权利要求1所述菌种保藏剂的制备方法，其特征在于：分别配制脱脂牛奶和硬葡聚糖溶液，经高压蒸汽灭菌，待其温度降至40~60℃范围内，在无菌条件下混合，得到冷冻干燥菌种保藏剂。3.一种如权利要求1所述菌种保藏剂用于保藏放线菌菌种的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）在无菌条件下，将菌种冷冻干燥保藏剂加入待保藏菌种培养成熟的茄子瓶斜面中，并用无菌接种针刮取斜面上层孢子，得单孢子悬液；（2）将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王耀耀，朱研研，李红珍，张雪霞，任风芝，郝惠云，王亚莉，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：