本发明专利技术公开了一种高效的21
【技术实现步骤摘要】
一种高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法
[0001]本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及一种高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法。
技术介绍
[0002]先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一组由于皮质激素合成过程中必需酶基因突变导致肾上腺皮质类固醇合成障碍所引起的疾病，是一种最常见的遗传性代谢疾病，21-羟化酶缺陷症(21-hydroxyulase deficiency，21-OHD)是最先发现、研究最多和最常见的一种先天性肾上腺皮质增生，占CAH的90-95％，是皮质醇合成障碍的常染色体隐性遗传疾病。人类21-羟化酶(CytochromeP450c21,CYP21)也称CYP21或P450c21，是机体合成皮质醇的关键酶之一，为一种仅表达于肾上腺组织中的细胞色素P450酶，该酶缺乏导致糖皮质和(或)盐皮质类固醇减少，ACTH和雄激素分泌增多，患者出现男性化和失盐症状，严重时威胁生命。
[0003]21-OHD临床谱很宽，严重的称为经典型，即出生时即有明显临床症状，轻型称为迟发型、非经典型。严重型包括两种病人：完全缺乏21-OH功能者(失盐型，SW)和部分缺失21-OH功能者(单纯男性化，SV)。失盐型是皮质醇和醛固酮两种合成途径的CYP21都受累。新生儿患者除了具有单纯男性化型的临床表现外，还有水盐失衡的表现；如拒乳、呕吐、脱水、休克。如得不到及时救治，死亡率甚高。失盐型患者大多数在出生后1～5周发病，6周以后发病者极少。单纯男性化型是只有皮质醇合成途径的CYP21受累，醛固酮合成途径正常。单纯男性化型临床表现为：
①
女性患者外生殖器有不同程度男性化(从阴蒂肥大到大阴唇融合，形成部分性阴茎尿道)。严重的病例一般有生殖窦存留(阴道和尿道只有一个开口)。卵巢、子宫和输卵管存在，附睾和输精管缺如。雄激素水平增高的另一个作用是使身体直线生长加速，身材比同龄儿童高，骨龄提前。ACTH产生过多可引起皮肤色素沉着。
②
男性患者表现为非促性腺激素释放激素(GnRH)依赖性性早熟，阴茎增大，阴毛生长，但是睾丸和促性腺激素仍停留在青春期前水平，皮肤色素沉着和身体直线生长加速与女性患者表现相同。非经典型(NC)为21-羟化酶轻微缺乏所致，该型患者临床表现多样，缺乏特异性，因此又称隐匿型或迟发型。女性患者出生时外生殖器发育正常，多在童年期、成年期出现轻度雄激素过多引起的临床表现时才被诊断。
[0004]21-OHD是由于编码类固醇的CYP21A2基因突变所致，CYP21A2基因定位于人类6号染色体短臂的HLA
ꢀⅢ
区(6p21.3)，共有10个外显子。人类基因组存在两个CYP21基因，即活性CYP21A2和无活性的假基因CYP21A1P。绝大多数突变源于有功能的CYP21基因和假基因之间的基因转换，假基因成了突变的源头。约90％的突变是由8个点突变和CYP21基因的缺失引起。目前针对21-OHD的诊断主要依赖于临床症状和生化检测，由于该诊断依据缺乏特异性和敏感性，导致21-OHD易发生误诊和漏诊，并且该方法无法对患者的基因型进行分析。因此，需寻找高效的、灵敏的诊断方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法，所述检测方法高效、灵敏，操作简单，耗时短，花费低，检测通量高、特异性强，检测结果准确可靠，适用于临床推广应用。
[0006]本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]一种高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法，包括如下步骤：
[0008]S1、提取待测样本的基因组DNA；
[0009]S2、针对要检测的CYP21A2基因上的点突变，根据NCBI中GenBank确定CYP21A2基因片段的序列，通过软件设计3对特异性引物，进行3个PCR扩增，其中3个引物分别记为引物1、引物2和引物3，其中引物1的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，引物2的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，引物3的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
[0010]具体地，引物序列为：
[0011]引物1：上游引物SEQ ID NO:1：TCTCGCCATGCTGCTCCT；下游引物SEQ ID NO:2：TGGAGGGTGGGAACTGATG；
[0012]引物2：上游引物SEQ ID NO:3：CCGGACCTGTCCTTGGGAGACTACT；下游引物SEQ ID NO:4：AAGTTGTCGTCCTGCCAGAAAAG；
[0013]引物3：上游引物SEQ ID NO:5：CTTTTCTGGCAGGACGACAACTTA；下游引物SEQ ID NO:6：GAGGCTCTCCTGCAGAGGGTGAA；
[0014]S3、使用序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的引物对所述基因组DNA进行长片段PCR扩增，得到长片段扩增产物；
[0015]S4、对所述长片段扩增产物使用限制性内切酶进行酶切，将酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对所述长片段扩增产物进行高通量测序检测。
[0016]优选地，所述提取待测样本的基因组DNA是使用德国QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit。
[0017]优选地，所述长片段PCR扩增的条件是：首先在95℃预处理2分钟，再以95℃、30秒——55～63℃、30秒——70℃、30秒依次处理进行30个循环，再在72℃延伸15分钟。
[0018]优选地，引物1、引物2、引物3的退火温度分别为55℃、59℃、63℃。
[0019]优选地，所述长片段PCR扩增的反应体系为：
[0020]10
×
PCR Buffer
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5μl；
[0021]dNTP Mix
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5μl；
[0022]上下游引物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3μl；
[0023]cDNA模板
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15μl；
[0024]Taq DNA聚合酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl；
[0025]去离子水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
21μl；
[0026]总体积
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50μL。
[0027]优选地，所述对扩增产物进行高通量测序检测包括如下步骤：
[0028](1)DNA破碎：将所述扩增产物打断成150-250的DNA片段；
[0029](2)末端修复：对所述DNA片段进行末端修复，并在末端修复的DNA片段的3
’
端加上A碱基；
[0030](3)连接测序接头：在连接上A碱基的DNA片段上连接测序接头；
[0031]本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、提取待测样本的基因组DNA；S2、针对要检测的CYP21A2基因上的点突变，根据NCBI中GenBank确定CYP21A2基因片段的序列，通过软件设计3对特异性引物，进行3个PCR扩增，其中3个引物分别记为引物1、引物2和引物3，其中引物1的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，引物2的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，引物3的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；S3、使用序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的引物对所述基因组DNA进行长片段PCR扩增，得到长片段扩增产物；S4、对所述长片段扩增产物使用限制性内切酶进行酶切，将酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对所述长片段扩增产物进行高通量测序检测。2.根据权利要求1所述的高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法，其特征在于，所述提取待测样本的基因组DNA是使用德国QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit。3.根据权利要求1所述的高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法，其特征在于，所述长片段PCR扩增的条件是：首先在95℃预处理2分钟，再以95℃、30秒——55～63℃、30秒——70℃、30秒依次处理进行30个循环，再在72℃延伸15分钟。4.根据权利要求3所述的高效的21-羟化酶缺陷症相关基因检测方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：段志峰，
申请(专利权)人：广州源古纪科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。