先天性巨结肠诊断标志物及其应用制造技术

本申请是202110323377.0的分案申请。本发明专利技术属于生物医学领域，具体涉及先天性巨结肠诊断标志物及其应用。该标记物为PRDM9，进一步为PRDM9转座子融合，所述PRDM9转座子融合的融合位点选自位于chr5:23262356的PRDM9

【技术实现步骤摘要】
先天性巨结肠诊断标志物及其应用
[0001]本申请是申请号为202110323377.0、申请日为2021年3月26日、专利技术名称为“先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用”的中国申请的分案申请。


[0002]本专利技术属于生物医学领域，具体涉及先天性巨结肠诊断标志物及其应用。

技术介绍

[0003]先天性巨结肠(Hirschsprung disease，HSCR)是一种儿童肠神经发育异常的出生缺陷疾病，病理机制为肠神经嵴细胞迁移和分化成肠神经元发生障碍，导致肠神经缺乏而发生持续性痉挛，是小儿常见的先天性肠道疾病之一。先天性巨结肠的早期表现为呕吐、腹胀、腹泻等，临床上会造成新生儿死亡或手术后反复肠炎、难治性便秘等并发症，严重影响患儿的生长发育和生活质量。
[0004]先天性巨结肠的及时诊治可以减少先天性巨结肠肠炎发生的危险，获得良好的预后。该疾病确诊需要术后病变组织的病理切片。术前诊断方法主要为钡剂灌肠，直肠活检、直肠测压，以判断是否要实施“巨结肠根治术”。目前，钡灌肠为最重要的诊断方法，原理为先天性巨结肠患儿的肠道存在无神经节段的狭窄、近端的扩张，钡灌肠后可见扩张和狭窄段而诊断为巨结肠。但该方法只能诊断出有典型肠道形态改变的患儿，灵敏度需要提高，诊断的准确度80％左右。直肠活检是直接取直肠组织，检测是否有神经节细胞的缺失，准确率高，但取样部位对结果有影响。该方法为介入有创型，且价格非常高，一般情况下该方法应用于钡灌肠不明显，或不适用的患儿，比如当患儿有坏死性小肠结肠炎(NEC)这种可能的时候，钡灌肠会导致肠穿孔，这种时候不适合用钡灌肠去诊断，才考虑用直肠活检。直肠测压是通过检测肛门内括约肌的松弛缺乏判定肠神经的支配异常，仅为辅助诊断方法，假阳性和假阴性都较多，不能用于单独检测。
[0005]此外，先天性巨结肠患儿大部分早在刚出生的新生儿期(一个月内)就会表现出新生儿腹胀、呕吐、肠梗阻等症状，但大部分从钡灌肠中不会看到明显的扩张和狭窄段。大多数患儿都是在3个月后经过反复的腹胀后，在钡灌肠下可见明显的扩张、狭窄段才诊断为巨结肠，确定行巨结肠根治术。由于引起早期新生儿腹胀可能的疾病还可能有肠紊乱、蛋白过敏、肠闭锁、肠狭窄、新生儿坏死性小肠结肠炎等，只有很少一部分是先天性巨结肠，钡灌肠又没有那么灵敏，这就给先天性巨结肠患儿的早期诊断带来了很大挑战，因此，急需一种灵敏度高的早期诊断方法，将这些先天性巨结肠患儿筛查出来，以便早干预，减少疾病的死亡率和改善预后。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]为克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用，为先天性巨结肠的早期及时诊断提供了一种新的准确、灵敏的检测途径。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0009]本专利技术的第一方面涉及PRDM9转座子融合的定量检测剂在制备先天性巨结肠诊断试剂或试剂盒中的应用；
[0010]所述PRDM9转座子融合的融合位点选自：
[0011]位于chr5:23262356的PRDM9
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type II
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1；和/或
[0012]位于chr5:23245181的PRDM9
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type II
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2。
[0013]可选的，如上所述的应用，所述早期诊断的诊断对象为年龄小于3个月的新生儿。
[0014]可选的，如上所述的应用，所述早期诊断的诊断对象为年龄小于1个月的新生儿。
[0015]可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂用于执行以下任一种方法：
[0016]聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
[0017]可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂为引物。
[0018]可选的，如上所述的应用，检测所述PRDM9
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type II
‑
1的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1～2所示，检测所述PRDM9
‑
type II
‑
2的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：3～4所示。
[0019]可选的，如上所述的应用，所述引物还包括内参引物；
[0020]所述PRDM9
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type II
‑
1所对应的野生型序列的内参引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：5～6所示，所述PRDM9
‑
type II
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2所对应的野生型序列的内参引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：7～8所示。
[0021]可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂还含有DNA提取试剂、双链特异性荧光染料、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
[0022]可选的，如上所述的应用，所述试剂或试剂盒的受试样品选自血液、组织、细胞样品中至少一种。
[0023]本专利技术的第二方面涉及如上所述应用中所定义的引物。
[0024]本专利技术的第三方面涉及含有如上所述应用中所定义的定量检测剂的试剂盒。
[0025]本专利技术的有益效果为：
[0026]本专利技术利用DNA诊断技术、率先采用高特异性的PRDM9转座子融合位点进行儿童先天性巨结肠的早期诊断，所采用的产品和方法，不仅能够使得先天性巨结肠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有确诊时间更早、操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠早期诊断的替代或辅助检测手段。本专利技术的标志物中，PRDM9
‑
type I AUC值为0.7885，PRDM9
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type II
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1为0.8503，PRDM9
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type II
‑
2为0.7791。3者联合检测AUC为0.9666，最佳界限对应特异性为95.35％，灵敏性为84.38％。用于疾病筛选时，灵敏性为100％时，特异性为76.74％。
[0027]进一步收集一个月内的新生儿腹胀患儿的血液DNA，检测PRDM9转座子融合，结果发现PRDM9
‑
type II则能比较好的区分巨结肠和非巨结肠，PRDM9
‑
type II
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1AUC为0.7414，PRDM9
‑
type II
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2为0.7098。两者联合检测AUC为0.7586，最佳界限对应特异性为72.41％，灵敏性为83.33％。由此可见，多种PRDM9转座子融合均可用于先天性巨结肠的诊断以及早期诊断和筛查，它们也均影响了该PRDM9基因的功能，因此，对PRDM9基因及其转座子融合在先天性巨结肠中的研究，填补了先天性巨结肠在诊断领域中的空白。
附图说明
[0028本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PRDM9的检测剂在制备先天性巨结肠诊断或辅助诊断产品中的应用；所述产品为试剂或试剂盒。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PRDM9的检测剂为PRDM9转座子融合的检测剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测剂包括引物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物包括以下a)～c)中的一种或多种：a)检测PRDM9基因的引物；b)检测PRDM9转座子融合的引物；c)内参引物。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于执行以下任一种检测方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦，朱云，钟微，夏慧敏，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心，
类型：发明
国别省市：