一种肿瘤基因诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术一方面公开了一种急性髓细胞白血病标志物在制备急性髓细胞白血病的诊断产品中的应用，所述的标志物为hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346。另一方面，本发明专利技术公开了一种诊断急性髓系白血病的试剂盒，所述试剂盒包括检测hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346表达水平的试剂。再一方面，本发明专利技术还公开了一种治疗急性髓系白血病的药物组合物，所述药物组合物包括hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的抑制剂。本发明专利技术的试剂盒能够作为AML诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低等特点。本发明专利技术的药物组合物对AML有较好的抑制作用，在AML治疗中具有重要的参考意义和现实意义。重要的参考意义和现实意义。重要的参考意义和现实意义。

【技术实现步骤摘要】
NO.4所示。
[0010]优选地，本专利技术所述的试剂盒的判定公式为Y＝0.058*Ahsa_circ_0000907+0.068*Bhsa_circ_0021346；其中，Ahsa_circ_0000907是hsa_circ_0000907的表达量，Bhsa_circ_0021346是hsa_circ_0021346的表达量；当Y≥0.45时判断为阳性，表示可能AML；当Y＜0.45时判为阴性，表示正常。
[0011]再一方面，本专利技术还公开了一种治疗急性髓系白血病的药物组合物，所述药物组合物包括hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的抑制剂。
[0012]优选地，本专利技术所述的hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的抑制剂为si
‑
hsa_circ_0000907和si
‑
hsa_circ_0021346。
[0013]优选地，本专利技术所述的si
‑
hsa_circ_0000907和si
‑
hsa_circ_0021346的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0014]本专利技术具有以下有益效果：
[0015]本专利技术通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，筛选用于AML诊断和治疗的环状RNA标志物。我们选择hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346作为组合标记物(在AML中，hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346均上调)。在此基础上，本专利技术提供了联合检测hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的表达水平的试剂在制备诊断AML的产品中的应用以及相关的检测试剂盒。本专利技术的试剂盒能够作为AML诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低等特点。
[0016]另外，本专利技术还提供了一种潜在的治疗AML的药物组合物的应用以及相关的药物组合物。本专利技术的药物组合物对AML有较好的抑制作用，在AML治疗中具有重要的参考意义和现实意义。
附图说明
[0017]图1hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346实时荧光定量PCR反应的溶解曲线图。
[0018]图2白血病小鼠模型生存率统计结果。
具体实施方式
[0019]以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0020]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0021]实施例1急性髓性白血病(AML)外周血中环状RNA的检测
[0022]样本收集：收集5例正常外周血以及5例AML外周血。所有参与者均签署了知情同意书，并经过医院伦理委员会批准。所有参与者均于早晨空腹状态下留取外周静脉血5ml，保存于
‑
70℃冰箱。
[0023]RNA提取：采用Trizol(15596026，Invitrogen，Car，Cal，USA)一步法提取外周血总RNA，NanoDrop ND
‑
2000仪检测纯度和浓度，A260/A280比值均在1.8～2.0之间。
[0024]RNA文库建立及测序：使用CircRNA Enrichment Kit(购自美国Cloud
‑
seq公司)和TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(购自美国Illumina公司)富集和预处理环状RNA，生成测序文库并检测质量。在Illumina HiSeq 4000测序仪上进行测序。
[0025]生物信息学分析：经测序仪测序，使用cutadapt软件处理，获得高质量clean reads。将clean reads进行比对，利用DCC软件检测和鉴定环状RNA。使用t检验进行两组样品的差异环状RNAs鉴定，利用标准化的reads数，以倍数变化(fold change)＞2.0，P
‑
value＜0.05作为差异环状RNA的阈值，即差异表达的环状RNA。结果显示，与正常组相比，AML组中有275个环状RNA表达上调，84个表达下调；其中hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346均为表达上调，且并跟预后相关；故选择hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346作为本研究的重点的环状RNA。其中hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0026]实施例2 AML外周血中的hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346检测
[0027]扩大收集样本：共收集40例样本，其中20份为AML患者，20例为正常外周血，置于
‑
70℃冰箱保存。所有参与者均签署知情同意书。
[0028]RNA提取：采用Trizol(15596026，Invitrogen，Car，Cal，USA)一步法提取外周血总RNA，NanoDrop ND
‑
2000仪检测纯度和浓度，A260/A280比值均在1.8～2.0之间。
[0029]逆转录：参照EasyScript First
‑
Strand cDNA Synthesis SuperMix(目录号AE301
‑
02，北京全式金，中国)说明书将RNA反转录成cDNA，实验体系20μl。
[0030]引物设计和合成：采用primer5.0设计引物，hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的序列如实施例1所示，选U6为内参。引物设计后由南京金斯瑞科技有限公司合成。具体引物序列如下表所示：
[0031][0032]实时荧光定量PCR反应：使用qPCR SYBR Green master mix(购自上海云序生物科技有限公司)在实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，USA)进行PCR反应，反应体系：2
×
master mix 5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cDNA 2μl，RNase Free dH2O 2μl。反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，连续进行40个循环。收集荧光。扩增反应后，设置95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s；并从60℃缓慢加热到99℃。记录各孔Ct值，以U6为内参。
[0033]结果显示：在AML中，hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346含量明显高于正常组，P＜0.01，与高通量测序结果一致；且引物设计符合检测要求。具体结果见图1和下表：
[0034]基因名称AML(平均2
‑△△
CT
)正常(平均2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种急性髓细胞白血病标志物在制备急性髓细胞白血病的诊断产品中的应用，其特征在于，所述的急性髓细胞白血病标志物为hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346。2.一种诊断急性髓系白血病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346表达水平的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增hsa_circ_0000907的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述特异性扩增hsa_circ_0021346的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的判定公式为Y＝0.058*A
hsa_circ_0000907
+0.068*B
hsa_circ_0021346
；其中，A...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄小容，黄少冬，
申请(专利权)人：黄小容，
类型：发明
国别省市：