用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT

【技术实现步骤摘要】
用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用。

技术介绍

[0002]马病毒性动脉炎病毒(EVAV)是一种有囊膜的单股RNA病毒，该病毒归属冠状病毒科动脉炎病毒属。马病毒性动脉炎病毒在低温条件下极稳定，在
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20℃保存7年仍有活性。通常情况下，马病毒性动脉炎病毒在4℃条件下可保存35天，在37℃环境下仅存活2天，56℃条件下30分钟可使其灭活。
[0003]马病毒性动脉炎主要是通过呼吸系统和生殖系统在马属动物间传播。患病马在急性期通过呼吸道分泌物将病毒传给同群马或与其相接触的马，流产马的胎盘、胎液、胎儿亦可传播本病，长期带毒的种公马可通过自然交配或人工授精的方式把病毒传给母马。另外，健康的易感马通过与受污染的饲具、饲料、饲养人员等接触可感染该病。人工接种病毒于怀孕母马及幼驹，可使50％的幼驹死亡，母马则发生流产。大多数自然感染的马表现为亚临诊症状，实验接种马可表现为临诊症状。本病的典型症状是发热，一般感染后3
‑
14天体温升高达 41℃，并可持续5
‑
9天。病马出现以淋巴细胞减少为特征的白细胞减少症，临诊病期大约14天。表现厌食、精神沉郁、四肢严重水肿，步伐僵直，眼、鼻分泌物增加，后期为脓性粘液，发生鼻炎和结膜炎。面部、颈部、臀部形成皮肤疹块。有的表现呼吸困难、咳嗽、腹泻、共济失调，公马的阴囊和包皮水肿，马驹和虚弱的马可引起死亡。怀孕母马流产，其流产可达90％以上。动脉炎病毒可突破胎盘屏障而感染胎儿，胎儿常在流产前就死亡。更重要的是大多数公马恢复后会成为病毒的长期携带者，持续向环境中排出病毒，故给高价值的马产业带来了严重的威胁。
[0004]实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其检测技术在于将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后, 当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；而当高温变性、低温复性、适温延伸的热循环过程中，随着PCR扩增时，Taq酶的5
’‑3’
外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，在特定光激发下其发出荧光，从而被荧光监测系统接收到荧光信号，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，荧光监测系统接收到的荧光信号也呈指数级增长。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。若同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，则可得出对应的不同Ct值，从而通过样品浓度与Ct值建立的曲线图得出待测样品中所含目的基因的拷贝数。
[0005]马病毒性动脉炎最早于1953年在美国的OHIO的BUCYRUS暴发，此后在美国的肯塔基地区发病马中也分离出病毒，经鉴定与BUCYRUS株一致。后来瑞士、波兰、奥地利、加拿大也都分离到本病病毒。此外在英国、日本、法国、西班牙、爱尔兰、葡萄牙、南斯拉夫、埃及、埃
塞俄比亚、摩洛哥、德国、瑞典、伊朗、印度、丹麦、荷兰、澳大利亚、新西兰和意大利等国家通过血清学调查证实有本病存在。由于我国至今仍为马病毒性动脉炎非疫区，故对该病的研究很少；同时，世界动物卫生组织至今还未明确指定该病可采用的具体荧光RT
‑
PCR检测用引物、探针及相应的反应体系与反应条件等。为防止该外来病传入我国以及维护我国生物安全，有必要未雨绸缪，及时建立用于检测马病毒性动脉炎病毒核酸的荧光RT
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PCR检测方法，以利于口岸机构针对该外来病进行有效监控。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提出一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用，解决了现有技术中缺乏用于检测马病毒性动脉炎病毒核酸的荧光RT
‑
PCR检测方法的技术问题。本专利技术优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]本专利技术用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物，包括如下序列：
[0009]EVAF1：5
’‑
GCCATTGAAGAGGCAAGTGTATTTA
‑3’
；
[0010]EVAF2：5
’‑
GGTCGCTGATTGACGCATACTGGG
‑3’
；
[0011]EVAR3：5
’‑
GTGCAAATCTAGCCCCGGGAAA
‑3’
；
[0012]EVAR4：5
’‑
GTCACCTGGGCTCACATCAAAA
‑3’
。
[0013]优选的，所述引物的配对方式为：上游引物EVAF1与下游引物EVAR3配对使用；或者上游引物EVAF2与下游引物EVAR4配对使用；或者上游引物 EVAF1、上游引物EVAF2、下游引物EVAR3和下游引物EVAR4同时使用。
[0014]本专利技术用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的探针，包括如下序列：
[0015]EVAP1：5
’‑
TTCCACCGACCACGCGTCTGCTAAGC
‑3’
；
[0016]EVAP2：5
’‑
CACCGTTTACGCGCTTCCCACCATATCTG
‑3’
；
[0017]所述探针分别采用荧光素标记探针序列的5
’
端，采用荧光淬灭基团标记探针序列的3
’
端；所述探针还包括本专利技术中任一项所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物，并且两条探针分别与引物对EVAF1、EVAR3 配对使用或者与引物对EVAF2、EVAR4配对使用；或者两条探针分别与引物对 EVAF1、EVAR3以及引物对EVAF2、EVAR4共同使用；或者两条探针与引物对EVAF1、EVAR3以及引物对EVAF2、EVAR4共同使用。
[0018]优选的，所述荧光素为Fam、Joe、Hex、Vic中的一种或多种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种或多种。
[0019]本专利技术用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的试剂盒，包括本专利技术中任一项所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的探针。
[0020]利用本专利技术中任一项的探针或试剂盒进行马病毒性动脉炎病毒实时荧光 RT
‑
PCR检测的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物，其特征在于，包括如下序列：EVAF1：5
’‑
GCCATTGAAGAGGCAAGTGTATTTA
‑3’
；EVAF2：5
’‑
GGTCGCTGATTGACGCATACTGGG
‑3’
；EVAR3：5
’‑
GTGCAAATCTAGCCCCGGGAAA
‑3’
；EVAR4：5
’‑
GTCACCTGGGCTCACATCAAAA
‑3’
。2.根据权利要求1所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物，其特征在于，所述引物的配对方式为：上游引物EVAF1与下游引物EVAR3配对使用；或者上游引物EVAF2与下游引物EVAR4配对使用；或者上游引物EVAF1、上游引物EVAF2、下游引物EVAR3和下游引物EVAR4同时使用。3.一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的探针，其特征在于，包括如下序列：EVAP1：5
’‑
TTCCACCGACCACGCGTCTGCTAAGC
‑3’
；EVAP2：5
’‑
CACCGTTTACGCGCTTCCCACCATATCTG
‑3’
；所述探针分别采用荧光素标记探针序列的5
’
端，采用荧光淬灭基团标记探针序列的3
’
端；所述探针还包括权利要求1或2所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
‑
PCR检测的引物，并且两条探针分别与引物对EVAF1、EVAR3配对使用或者与引物对EVAF2、EVAR4配对使用；或者两条探针分别与引物对EVAF1、EVAR3以及引物对EVAF2、EVAR4共同使用；或者两条探针与引物对EVAF1、EVAR3以及引物对EVAF2、EVAR4共同使用。4.根据权利要求3所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
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PCR检测的探针，其特征在于，所述荧光素为Fam、Joe、Hex、Vic中的一种或多种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种或多种。5.一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT
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PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3或4所述的用于马病毒性动脉炎病毒实...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱道中，曹志玲，熊文杰，佟铁铸，李明，鱼海琼，罗琼，
申请(专利权)人：广州海关技术中心，
类型：发明
国别省市：