一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒，将病毒包膜抗原的单克隆抗体进行生物素修饰，将磁珠与链霉亲和素进行偶联；然后将生物素修饰的单克隆抗体与含有病毒的溶液进行孵育，抗体与病毒颗粒或抗原形成复合物，然后加入已经偶联链霉亲和素的磁珠进行孵育，磁珠上的链霉亲和素将与偶联了生物素的抗体进行高特异高亲和力结合，进而特异性地俘获具有包膜的病毒颗粒，再通过磁分离器分离上清液后，完整病毒颗粒及空壳病毒、游离的包膜抗原可以与其它病毒组分分离，然后通过PCR扩增对磁珠结合物进行定性或者定量检测。本发明专利技术免疫分子病毒颗粒检测方法具有简便、快速、准确、成本低等特点，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及病毒颗粒的检测，具体涉及一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒。

技术介绍

[0002]病毒感染(viral infection)是病毒通过某种或者多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程。病毒感染的实质是病毒与机体、病毒与易感细胞相互作用的过程。病毒感染常因病毒种类、机体状态不同产生轻重不一的损伤或病毒性疾病。病毒致病是由侵入宿主、感染细胞开始的，其中位于病毒包膜的受体结合蛋白质与宿主受体结合是感染的开展，位于病毒核心的病毒基因组(RNA或者DNA)是病毒转录复制的基础。如果病毒具有感染宿主的活性，其基本特征是位于包膜的受体结合蛋白质具有活性，位于病毒颗粒核心的病毒基因组保持完整。
[0003]现有的病毒检测方法目前的病毒检测方法主要是免疫检测和分子检测两类。以新冠病毒的检测为例。目前新冠病毒的免疫检测主要是基于新冠病毒N蛋白的抗原检测和基于N和(或)S(或者RBD)免疫产生的抗体进行检测，以及基于病毒RNA的核酸检测。现有的商品化或者文献报道的病毒免疫检测和分子检测都只是检测病毒抗原或者核酸，都无法检测具有感染活性的病毒颗粒。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒。
[0005]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒，包括单克隆抗体、生物素、磁珠和链霉亲和素；所述单克隆抗体为病毒包膜抗原的单克隆抗体。
[0007]利用上述试剂盒检测病毒颗粒的流程为：将病毒包膜抗原的单克隆抗体进行生物素(biotin)修饰，将磁珠与链霉亲和素进行偶联；然后将生物素修饰的单克隆抗体与含有病毒的溶液进行孵育，抗体与病毒颗粒或抗原形成复合物，然后加入已经偶联链霉亲和素的磁珠进行孵育，磁珠上的链霉亲和素将与偶联了生物素的抗体进行结合，进而俘获具有包膜的病毒颗粒，再通过磁分离器分离上清液后，完整病毒颗粒及空壳病毒、游离的包膜抗原可以与其它病毒组分分离，然后通过PCR扩增对磁珠结合物进行定性或者定量检测。
[0008]根据本专利技术的一个实施方案，所述病毒包膜抗原为宿主受体结合的病毒蛋白质。
[0009]根据本专利技术的一个实施方案，所述其它病毒组分为亚病毒颗粒组分，如蛋白质
‑
病毒RNA/DNA复合物，游离的病毒基因片段等。
[0010]根据本专利技术的一个实施方案，所述PCR扩增优选荧光定量PCR或数字PCR等温扩增。
[0011]单克隆抗体生物素修饰方法为：用碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)或硼酸缓冲液(pH 8.6)对单克隆抗体透析，向单克隆抗体溶液中加入用DMSO溶解的生物素，在室温下持续搅拌，保温2
‑
4小时；加入NH4Cl，在室温下搅拌5
‑
15分钟；除去游离的生物素；将样品上分子筛
柱，以PBS洗脱，收集蛋白质；加入叠氮钠及BSA形成将结合产物。
[0012]磁珠偶联链霉亲和素方法为：取磁珠至EP管中，磁力分离，用预冷MES缓冲液洗涤；施加磁场，去上清，将NHS与等量EDC溶液加入EP管中，震荡，20
‑
30℃活化磁珠20
‑
40min；借助磁力架，用预冷的MES溶液洗涤磁珠；将待偶联的链霉亲和素用预冷MES溶液稀释，将活化好的磁珠用MES溶液重悬，摇晃使磁珠全部分散；取活化磁珠悬液，将活化磁珠悬液加入稀释好的链霉亲和素悬液中，加入磁珠后，4℃旋转混匀4h；施加磁场，将上清移去，向管中加入BSA封闭液，20
‑
30℃旋转20
‑
40min；借助磁力架，用PBS将磁珠清洗；向管中转移保存液，将偶联成功链霉亲和素的磁珠悬起，4℃保存。
[0013]病毒颗粒与生物素标记抗体的结合及链霉亲和素偶联磁珠捕获方法为：取细胞上清至EP管中，加入已经偶联好的生物素修饰单克隆抗体进行孵育结合，20
‑
30℃旋转结合5
‑
15min；加入链霉亲和素磁珠偶联物，混匀，20
‑
30℃旋转结合30
‑
50min；施加磁场后，弃上清，得到完整病毒颗粒、空壳病毒及游离的包膜抗原。
[0014]根据本专利技术的一个实施方案，所述病毒选自甲肝病毒(hepatitis A virus，HAV)、乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)、丙肝病毒(Hepatitis C virus，HCV)、丁肝病毒(Hepatitis D virus,HDV)、戊肝病毒(Hepatitis E virus，HEV)、新冠病毒(SARS CoV
‑
2)、艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、流感病毒(influenza virus)、偏肺病毒(Partial pulmonary virus)、人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、疱疹病毒(herpes virus)、单纯疱疹病毒(herpesvirus hominis)、寨卡病毒(Zika virus)、埃博拉病毒(Ebola virus，EBV)、人类嗜T淋巴细胞病毒(Human T
‑
lymphocytic virus)、禽流感病毒(avian influenza virus)、猪瘟病毒(hog cholera virus，CSFV)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒(rabies virus)、腺病毒(adenovirus)、慢病毒(lentivirus)等常见病毒的完整病毒颗粒(即具有感染活性病毒颗粒)。
[0015]有益效果：
[0016]本专利技术提供一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒，将病毒包膜抗原的单克隆抗体进行生物素(biotin)修饰，将磁珠与链霉亲和素进行偶联；然后将生物素修饰的单克隆抗体与含有病毒的溶液进行孵育，抗体与病毒颗粒或抗原形成复合物，然后加入已经偶联链霉亲和素的磁珠进行孵育，磁珠上的链霉亲和素将与偶联了生物素的抗体进行高特异高亲和力结合，进而特异性地俘获具有包膜的病毒颗粒，再通过磁分离器分离上清液后，完整病毒颗粒及空壳病毒、游离的包膜抗原可以与其它病毒组分(蛋白质
‑
病毒RNA/DNA复合物，游离的病毒基因片段等亚病毒颗粒组分)分离，然后通过PCR扩增对磁珠结合物进行定性或者定量检测。空壳病毒等亚病毒颗粒因为没有基因组而无法被扩增，只有完整病毒颗粒才有分子检测阳性信号。因此定量PCR检测到的病毒基因的就是来源完整病毒的病毒基因，其检测信号就是完整病毒颗粒的信号。本专利技术免疫分子病毒颗粒检测方法具有简便、快速、准确、成本低等特点，具有良好的应用前景。
附图说明
[0017]图1是本专利技术免疫分子法检测病毒颗粒流程图；
[0018]图2是本专利技术免疫分子病毒颗粒检测试剂盒检测HepG 2.2.1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒，包括单克隆抗体、生物素、磁珠和链霉亲和素；所述单克隆抗体为病毒包膜抗原的单克隆抗体；所述试剂盒检测病毒颗粒的流程为：将病毒包膜抗原的单克隆抗体进行生物素(biotin)修饰，将磁珠与链霉亲和素进行偶联；然后将生物素修饰的单克隆抗体与含有病毒的溶液进行孵育，抗体与病毒颗粒或抗原形成复合物，然后加入已经偶联链霉亲和素的磁珠进行孵育，磁珠上的链霉亲和素将与偶联了生物素的抗体进行结合，进而俘获具有包膜的病毒颗粒，再通过磁分离器分离上清液后，完整病毒颗粒及空壳病毒、游离的包膜抗原可以与其它病毒组分分离，然后通过PCR扩增对磁珠结合物进行定性或者定量检测。2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述病毒包膜抗原为宿主受体结合的病毒蛋白质。3.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述其它病毒组分为亚病毒颗粒组分。4.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述亚病毒颗粒组分为蛋白质
‑
病毒RNA/DNA复合物或游离的病毒基因片段。5.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增优选荧光定量PCR或数字PCR等温扩增。6.如权利要求1
‑
5任一项所述试剂盒，其特征在于：单克隆抗体生物素修饰方法为用碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)或硼酸缓冲液(pH 8.6)对单克隆抗体透析，向单克隆抗体溶液中加入用DMSO溶解的生物素，在室温下持续搅拌，保温2
‑
4小时；加入NH4Cl，在室温下搅拌5
‑
15分钟；除去游离的生物素；将样品上分子筛柱，以PBS洗脱，收集蛋白质；加入叠氮钠及BSA形成将结合产物。7.如权利要求1
‑
5任一项所述试剂盒，其特征在于：磁珠偶联链霉亲和素方法为取磁珠至EP管中，磁力分离，用预冷MES缓冲液洗涤；施加磁场，去上清，将NHS与等量EDC溶液加入EP管中，震荡，20
‑
30℃活化磁珠20
‑
40min；借助磁力架，用预冷的MES溶液洗涤磁珠；将待偶联的链霉亲和素用预冷MES溶液稀释，将活化好的磁珠用MES溶液重悬，摇晃使磁珠全部分散；取活化磁珠悬液，将活化磁珠悬液加入稀释好的链霉亲和素悬液中，加入磁珠后，4℃旋转混匀4h；施加磁场，将上清移去，向管中加入BSA封闭液，20
‑
30℃旋转20
‑
40min；借助磁力架，用PBS将磁珠清洗；向管中转移保存液，将偶联成功链霉亲和素的磁珠悬起，4℃保存。8.如权利要求1
‑
5任一项所述试剂盒，其特征在于：病毒颗粒与生物素标记抗体的结合及链霉亲和素偶联磁珠捕获方法为取细胞上清至EP管中，加入已经偶联好的生物素修饰单克隆抗体进行孵育结合，20
‑
30℃旋转结合5
‑
15min；加入链霉亲和素磁珠偶联物，混匀，20
‑
30℃旋转结合30
‑
50min；施加磁场后，弃上清，得到完整病毒颗粒、空壳病毒及游离的包膜抗原。9.一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒，包括单克隆抗体、生物素、磁珠和链霉亲和素；所述单克隆抗体为病毒包膜抗原的单克隆抗体；所述试剂盒检测病毒颗粒的流程为：将病毒包膜抗原的单克隆抗体进行生物素(biotin)修饰，将磁珠与链霉亲和素进行偶联；然后将生物素修饰的单克隆抗体与含有病毒的溶液进行孵育，抗体与病毒颗粒或抗原形成复合物，然后加入已经偶联链霉亲和素的磁珠进行孵育，磁珠上的链霉亲和素将与偶联了生物素的抗体进行结合，进而俘获具有包膜的...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪德强，伍晓莉，刘俊叶，蔡雪飞，黄爱龙，毛胜蓝，王雯，沈仕梅，马园艳，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：