淡水长臂大虾小RNA病毒的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种淡水长臂大虾小RNA病毒的检测方法，即MrPV

【技术实现步骤摘要】
淡水长臂大虾小RNA病毒的检测方法


[0001]本专利技术属于水产病毒的检测
更具体地，涉及一种淡水长臂大虾小RNA病毒的检测方法。

技术介绍

[0002]淡水长臂大虾(Macrobrachium rosenbergii)作为外来物种引入我国已有40多年历史，因其经济效益显著，成为了我国主要淡水养殖虾类。但病害的发生使水产养殖业的发展受到影响。国内目前报道的可感染淡水长臂大虾并引发病害的病毒有：白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)，野田村病毒(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus，MrNV)以及细小病毒样病毒(parvo
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like virus，HPV)等，还有一些病害尚未明确病原。随着对水产疾病研究的深入，越来越多的证据表明，导致同种水产疾病的可能不只有一种病毒，例如白尾病的病原就有野田村病毒(MrNV)和可能作为MrNV卫星病毒或辅助病毒的极小病毒(extra small virus
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like particles，XSV)两种。
[0003]“铁壳虾”病的出现使得淡水长臂大虾的产量显著下降，确立“铁壳虾”病的病原，建立相应的检测方法，对淡水长臂大虾养殖产业的健康和长远发展具有重大意义。本专利技术通过对表现出“铁壳”症状的虾体内的病毒进行富集以及宏病毒组测序，发现了一种新的小RNA病毒，暂将其命名为Macrobrachium rosenbergii picorna virus 7(MrPV
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7)。针对此病毒建立一种快速、准确、灵敏且特异性强的检测方法，将有助于及早确认养殖的淡水长臂大虾中是否有感染MrPV
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7，以便对潜在风险进行针对性处理。
[0004]针对水产动物病毒病原进行检测的方法有原位杂交、酶联免疫吸附、PCR及LAMP等，在实际检测过程中，原位杂交和酶联免疫吸附耗时长且灵敏度不高，LAMP则存在假阳性较高的情况。巢式PCR法对靶序列的检测灵敏度和特异性高，现已广泛应用于水产疾病的检测，如李晨等建立了栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒巢式PCR检测方法(李晨,王崇明,曲朋,等.栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒巢式PCR检测方法的建立[J].水产学报,2013,37(002):281
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287.)。荧光定量PCR法的耗时更短，且通过和绝对定量标准曲线的比对，可以对样品进行定量检测，也已广泛应用于水产疾病的检测，如刘宝彬等构建的凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及虾肝肠胞虫的荧光定量PCR检测方法(刘宝彬,杨冰,吕秀旺,等.凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及虾肝肠胞虫(EHP)的荧光定量PCR检测[J].渔业科学进展,2017,38(002):158
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166.)，但目前还未有针对MrPV
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7的PCR检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种淡水长臂大虾小RNA病毒的检测方法，即MrPV
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7的检测方法。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种淡水长臂大虾小RNA病毒的检测方法。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测淡水长臂大虾小RNA病毒的靶序列。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种用于检测所述靶序列的引物组。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供一种淡水长臂大虾小RNA病毒的检测试剂盒。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供所述靶序列在制备检测淡水长臂大虾小RNA病毒的产品中的应用。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供所述引物组在制备检测淡水长臂大虾小RNA病毒的产品中的应用。
[0012]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0013]淡水长臂大虾即罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)。本专利技术通过对表现出“铁壳”症状的虾体内的病毒进行富集及宏病毒组测序，在淡水长臂大虾中发现了一种新的小RNA病毒，暂将其命名为Macrobrachium rosenbergii picorna virus 7(MrPV
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7)，病毒的基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]本专利技术参照国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)对小核糖核酸病毒科Picornaviridae的系统发育分析，通过贝叶斯建树，对小核糖核酸病毒目Picornavirales下8个科内多个属的代表种，未分类到属的暂定种，以及所发现的多个MrPV病毒，利用RNA聚合酶基因进行了系统发育分析。系统发育分析结果发现，MrPV
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7与其余MrPV的亲缘关系较远，分属不同科，其与Solinviviridae科的进化关系较近，但保持较远的进化距离，也不能划为一科。
[0015]本专利技术在SEQ ID NO.1所示基因组序列的基础上，以基因组中第7754～8717位的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)为靶序列，设计筛选得到了用于检测淡水长臂大虾小RNA病毒MrPV
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7的巢氏PCR引物和荧光定量PCR引物，建立了相应的检测方法。
[0016]本专利技术申请保护SEQ ID NO.2所示靶序列在制备检测淡水长臂大虾小RNA病毒的产品中的应用。
[0017]本专利技术提供了一种用于检测SEQ ID NO.2所示靶序列的引物组。
[0018]优选地，所述引物组为巢氏PCR引物，其序列如SEQ ID NO.3～6所示。
[0019]优选地，所述引物组为荧光定量PCR引物，其序列如SEQ ID NO.7～8所示。
[0020]本专利技术还提供了一种检测淡水长臂大虾小RNA病毒的试剂盒，其包含检测SEQ ID NO.2所示靶序列的试剂。
[0021]优选地，所述试剂中包含检测SEQ ID NO.2所示靶序列的引物组。
[0022]优选地，所述试剂中包含检测SEQ ID NO.2所示靶序列的巢氏PCR引物，引物序列如SEQ ID NO.3～6所示。
[0023]优选地，所述试剂中包含检测SEQ ID NO.2所示靶序列的荧光定量PCR引物，引物序列如SEQ ID NO.7～8所示。
[0024]优选地，所述检测淡水长臂大虾小RNA病毒的试剂盒中还包含有SEQ ID NO.2所示靶序列的重组质粒作为阳性对照。
[0025]本专利技术同时申请保护上述引物组在制备检测淡水长臂大虾小RNA病毒的产品中的应用。
[0026]本专利技术还提供了一种检测淡水长臂大虾小RNA病毒的巢氏PCR方法，其包含以下步骤：
[0027]S1.提取待测样本的RNA并反转录为cDNA；
[0028]S2.以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淡水长臂大虾小RNA病毒的检测方法，其特征在于，以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为靶序列设计引物，通过PCR反应进行检测。2.一种用于检测淡水长臂大虾小RNA病毒的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种用于检测权利要求2所述靶序列的引物组。4.根据权利要求3所述引物组，其特征在于，所述引物组为巢氏PCR引物，引物序列依次如SEQ ID NO.3～6所示。5.根据权利要求3所述引物组，其特征在于，所述引物组为荧光定量PCR引物，引物序列依...

【专利技术属性】
技术研发人员：何建国，缪琪瑾，翁少萍，周丹丹，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：