本发明专利技术公开了牛扩展多能性胚胎干细胞(bEPSC)的建系方法及培养液，该胚胎干细胞产品从牛胚胎中分离、诱导得到，并能够稳定传代培养。该胚胎干细胞具有全能性、稳定性和安全性，可用于牛(乳用品种、肉用品种、兼用品种或役用品种等)育种繁育、基因编辑、动物克隆、医学模型、药物开发载体和诱导生产牛生殖配子等多种生命科学以及医学领域的应用，并可以进行大规模生产应用。大规模生产应用。
【技术实现步骤摘要】
28343.)从CDX2敲出的胚胎中获得牛扩展多能性胚胎干细胞(CDX2-KD bESCs)，具有体内外分化能力，但没有形成嵌合体。赵丽霞等(Characterization of the single-cell derived bovine induced pluripotent stem cells[J].Tissue&Cell，2017，49(5):521-527)转入牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc到牛体细胞中获得具有三胚层分化能力的牛诱导多功能干细胞。Yanina Soledad Bogliotti等(Efficient derivation of stable primed pluripotent embryonic stem cells from bovine blastocysts[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2018，115(9):2090-2095.)从牛胚胎中获得了激发态胚胎干细胞(primed bESCs)，该干细胞没有报道形成嵌合体，其全能性不如小鼠原始态胚胎干细胞(naive mESCs)。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供一种牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法及培养液，首次从附植前的牛胚胎中高效率分离、诱导出牛扩展多能性胚胎干细胞(bEPSCs)，该干细胞能在体外和嵌合体中向胚胎和胚胎外组织分化，具有全能性、稳定性和安全性。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案实现：一种牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法，其特征在于：它包括以下步骤：取牛体外受精后第六天胚胎，用BO-WASH培养基冲洗两次，接种于提前解冻好的牛成纤维细胞的饲养层细胞上，在添加10μM Y-27632的细胞因子培养液培养；第5天后观察细胞长出，换成细胞因子培养液；隔天换液，第12到14天构建成牛扩展多能性胚胎干细胞系，其中，Y-27632结构式为：
[0008][0009]优选地，所述饲养层细胞的制备方法为：解冻牛成纤维细胞，待细胞汇合度达到80％以上，按照1：16进行细胞传代；待细胞的汇合度再次达到80％时，添加10μg/ml的丝裂霉素于培养箱中培养2.5-3h；胰酶消化后用牛成纤维细胞培养液中止消化，离心并去上清，用含10％DMSO、10％胎牛血清和80％牛成纤维细胞培养液的培养液重悬并冻存为饲养层细胞。
[0010]优选地，所述牛成纤维细胞培养液是在DMEM培养基中，添加10％胎牛血清，1
×
谷氨酰胺，1
×
非必需氨基酸，1
×
青链霉素。
[0011]优选地，所述牛扩展多能性胚胎干细胞的传代包括以下步骤：当牛扩展多能性胚胎干细胞的汇合度达到80％时，胰酶消化后用K10培养液中止消化，按1：2或1：4隔日传代。
[0012]优选地，所述K10培养液是在F12/DMEM培养基中，添加10％KSR，1
×
谷氨酰胺，1
×
非必需氨基酸，1
×
青链霉素。
[0013]优选地，所述牛的种类选自乳用品种、肉用品种、兼用品种或役用品种。
[0014]优选地，所述细胞因子培养液包括：(1)有效量的成纤维细胞生长因子或其等效物；(2)有效量的一种或多种Wnt信号通路抑制剂；(3)有效量的GSK-3α/β信号通路抑制剂；(4)有效量的Lck/Src信号通路抑制剂；(5)有效量的Activin A蛋白或其等效物。
[0015]优选地，所述Wnt信号通路抑制剂为IWR-1、XAV-939、ICG-001、Wnt-C59、LGK-974、
LF3、CP21R7、NCB-0846、PNU-74654SKL2001、KY02111、IWP-2、IWP-L6、FH535、WIKI4、PRI-724、IQ-l、KYA1797K、C59、ETC-159、G007-LK、G244-LM中的一种或多种。
[0016]优选地，所述GSK-3α/β信号通路抑制剂为CHIR99021、B216763、AT7519、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、2-D08、6-溴靛玉红-3'-丙酮肟(BIO-acetoxime)、IM-12、1-氮杂坎帕罗酮(1-Azakenpaullone)、靛玉红(Indirubin)或ATP抑制剂Bikinin。
[0017]优选地，所述Lck/Src信号通路抑制剂为WH-4-023、达沙替尼(Dasatinib)、塞卡替尼(Saracatinib)、普纳替尼(Ponatinib)、SKI-606，Src抑制剂KX2-391(Tirbanibulin)、NVP-BHG712、PP2或PP121。
[0018]一种牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法用细胞因子bEPSCM培养液，其组成为：
[0019]mTeSR
TM1[0020]100X青链霉素
[0021]0.1mM 2-巯基乙醇
[0022]1μM CHIR99021
[0023]0.3μM WH-4-023
[0024]5μM XAV939 or 5μM IWR-1
[0025]50μg/ml vitamin C
[0026]10ng/ml LIF
[0027]20.0ng/ml Activin A
[0028]其中，IWR-1结构式为：
[0029][0030]CHIR99021结构式为：
[0031][0032]WH-4-023结构式为：
[0033][0034]XAV939结构式为：
[0035][0036]本专利技术的有益效果是：
[0037](1)首次从附植前的牛胚胎中高效率分离、诱导出牛扩展多能性胚胎干细胞(bEPSCs)；
[0038](2)构建的牛扩展多能性胚胎干细胞，具有全能性、稳定性和安全性；
[0039](3)利用该方法的牛扩展多能性胚胎干细胞建系效率快并能够在体外稳定传代；
[0040](4)该干细胞能在体外和嵌合体中向胚胎和胚胎外组织分化；
[0041](5)该方法制备的胚胎干细胞能够用于育种繁育、基因编辑、动物克隆、医学模型、药物开发载体和诱导生产牛生殖配子等多种生命科学以及医学领域。
附图说明
[0042]图1是本专利技术所述的牛扩展多能性胚胎干细胞。
[0043]图2是本专利技术所述的牛扩展多能性胚胎干细胞AP染色图片。
[0044]图3是本专利技术所述的牛扩展多能性胚胎干细胞多能基因检测图片。
[0045]图4是本专利技术所述的牛扩展多能性胚胎干细胞畸胎瘤图片。
[0046]图5是本专利技术所述的牛扩展多能性胚胎干细胞嵌合本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法，其特征在于，取牛体外受精后第六天胚胎，用BO-WASH培养基冲洗两次，接种于提前解冻好的牛成纤维细胞的饲养层细胞上，在添加10μM Y-27632的细胞因子培养液培养；第5天后观察细胞长出，换成细胞因子培养液；隔天换液，第12到14天构建成牛扩展多能性胚胎干细胞系，其中，Y-27632结构式为：2.根据权利要求1所述的牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法，其特征在于，所述饲养层细胞的制备方法为：解冻牛成纤维细胞，待细胞汇合度达到80％以上，按照1：16进行细胞传代；待细胞的汇合度再次达到80％时，添加10μg/ml的丝裂霉素于培养箱中培养2.5-3h；胰酶消化后用牛成纤维细胞培养液中止消化，离心并去上清，用含10％DMSO、10％胎牛血清和80％牛成纤维细胞培养液的培养液重悬并冻存为饲养层细胞。3.根据权利要求2所述的牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法，其特征在于：所述牛成纤维细胞培养液是在DMEM培养基中，添加10％胎牛血清，1
×
谷氨酰胺，1
×
非必需氨基酸，1
×
青链霉素。4.根据权利要求1-3任一所述的牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法，其特征在于：所述牛种类选自乳用品种、肉用品种、兼用品种或役用品种。5.根据权利要求1-3任一所述的牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法，其特征在于，所述细胞因子培养液包括：(1)有效量的成纤维细胞生长因子或其等效物；(2)有效量的一种或多种Wnt信号通路抑制剂；(3)有效量的GSK-3α/β信号通路抑制剂；(4)有效量的Lck/Src信号通路抑制剂；(5)有效量的Activin A蛋白或其等效物。6.根据权利要求5所述牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法，其特征在于，所述Wnt信号通路抑制剂为IWR-1、XAV-939、ICG-001、Wnt-C59、LGK-9...
【专利技术属性】
技术研发人员：李喜和，赵丽霞，王子馨，包斯琴，刘澎涛，曹贵芳，
申请(专利权)人：内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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