牛诱导扩展多能性成体干细胞、建系方法及培养液技术

本发明专利技术公开了一种牛诱导扩展多能性成体干细胞、建系方法及培养液，通过从牛成纤维体细胞中转基因、诱导培养得到，并能够在体外稳定传代培养。该干细胞具有全能性、稳定性和安全性，能在体内外向胚胎和胚胎外组织分化，可用于育种繁育、基因编辑、动物克隆、医学模型、药物开发载体和诱导生产牛生殖配子等多种生命科学以及医学领域的应用。命科学以及医学领域的应用。命科学以及医学领域的应用。

【技术实现步骤摘要】
牛诱导扩展多能性成体干细胞、建系方法及培养液


[0001]本专利技术属于细胞生物学和分子生物学
，具体涉及一种牛诱导扩展多能性成体干细胞、建系方法及培养液。

技术介绍

[0002]诱导多能干细胞(iPSCs)是将特定转录因子导入到体细胞，诱导其细胞核重编程而得到的干细胞，是通过在分化的细胞中表达特定的几个转录因子，诱导体细胞的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。诱导多能干细胞(iPSCs)除了可以无限的自我更新并能分化为包括三个胚层在内的所有细胞类型外，最大的特点是不需使用胎儿或胚胎，而是将分化细胞通过基因表达的调整直接重编程到多能性阶段，在研究体细胞重编程和再生医学方面具有深远影响。
[0003]目前研究已经报道了小鼠(Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature，1981，292(5819):154
‑
156.)、人(Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts[J].Science，1998，282(5391):1145
‑
1147.)、大鼠(Germline Competent Embryonic Stem Cells Derived from Rat Blastocysts[J].Cell，2008，135(7):1299
‑
1310.)、猪(Establishment of porcine and human expanded potential stem cells[J].Nature Cell Biology，2019，21(6):687
‑
699.)、羊、马、牛的iPS细胞，但大动物iPS的多能性特别是嵌合体形成和生殖细胞传代还没有得到确认。李荣风等(Establishment of bovine trophoblast stem
‑
Like cells from In vitro
‑
produced blastocyst
‑
stage embryos using two inhibitors[J].Stem Cells and Development，2014，23(13):1501
‑
1514.)研究报道从附植前的胚胎细胞中获得牛滋养层干细胞(BTSCs)，该细胞注射NOD
‑
SCID小鼠能形成畸胎瘤，并在体外分化成胎盘样细胞。吴侠等(Establishment of bovine embryonic stem cells after knockdown of CDX2[J].Scientific Reports，2016，6(1):28343
‑
28343.)从CDX2敲出的胚胎中获得牛扩展多能性胚胎干细胞(CDX2
‑
KD bESCs)，具有体内外分化能力，但没有形成嵌合体。赵丽霞等(Characterization of the single
‑
cell derived bovine induced pluripotent stem cells[J].Tissue&Cell，2017，49(5):521
‑
527)转入牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc到牛体细胞中获得具有三胚层分化能力的牛诱导多功能干细胞。Yanina Soledad Bogliotti等(Efficient derivation of stable primed pluripotent embryonic stem cells from bovine blastocysts[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2018，115(9):2090
‑
2095.)从牛胚胎中获得了激发态胚胎干细胞(primed bESCs)，该干细胞没有报道形成嵌合体，其全能性不如小鼠原始态胚胎干细胞(naive mESCs)。

技术实现思路

[0004]本研究首次从牛成纤维体细胞中转基因、诱导培养得到牛诱导扩展多能性成体干
细胞(bEPSC
iPS
)，该干细胞能在体内外中向胚胎和胚胎外组织分化，具有全能性、稳定性和安全性。
[0005]上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案实现：
[0006]一种牛诱导扩展多能性成体干细胞的建系方法，包括以下步骤:
[0007](a)解冻牛成纤维细胞(BEF)，在牛成纤维细胞培养液上培养，待细胞汇合度达到80％以上，收集细胞计数1
×
106；
[0008](b)转入外源基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、LIN28、Nanog、LRH1和RARG，在提前解冻的饲养层细胞上培养，培养条件为M15+DOX培养液；
[0009](c)待干细胞克隆长出后，挑入细胞因子培养液培养，隔天换液，1到5天构建成牛诱导扩展多能性成体干细胞系。
[0010]优选地，所述外源基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、LIN28、Nanog、LRH1和RARG的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1
‑
8所示。
[0011]优选地，所述饲养层细胞的制备方法为：解冻牛成纤维细胞，在牛成纤维细胞培养液上培养，待细胞汇合度达到80％以上，按照1：16进行细胞传代，待细胞的汇合度再次达到80％时，添加10μg/ml的丝裂霉素于培养箱中培养2.5
‑
3h，胰酶消化后用BEF培养液中止消化，离心并去上清，经含10％DMSO、10％胎牛血清和80％牛成纤维细胞培养液的培养液重悬并冻存为饲养层细胞。
[0012]优选地，所述步骤(b)中的提前解冻的饲养层细胞为实验前一天，解冻冻存的饲养层细胞并将其接种于铺有0.1％明胶的培养皿中用牛成纤维细胞培养液培养。
[0013]优选地，所述BEF培养液是在DMEM培养基中，添加10％FBS，1
×
谷氨酰胺，1
×
非必需氨基酸，1
×
青链霉素。
[0014]优选地，所述M15+DOX培养液是在DMEM培养基中，添加15％FBS、1
×
谷氨酰胺、1
×
非必需氨基酸、1
×
青链霉素、强力霉素Dox。
[0015]一种牛诱导扩展多能性成体干细胞建系用细胞因子培养液，所述细胞因子培养液包括：(1)有效量的成纤维细胞生长因子或其等效物；(2)有效量的一种或多种Wnt信号通路抑制剂；(3)有效量的一种或多种GSK
‑
3α/β信号通路抑制剂；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛诱导扩展多能性成体干细胞的建系方法，其特征在于，包括以下步骤:(a)解冻牛成纤维细胞，在牛成纤维细胞培养液上培养，待细胞汇合度达到80％以上，收集细胞计数1
×
106；(b)转入外源基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、LIN28、Nanog、LRH1和RARG，在提前解冻的饲养层细胞上培养，培养条件为M15+DOX培养液；(c)待干细胞克隆长出后，挑入细胞因子培养液培养，隔天换液，1到5天构建成牛诱导扩展多能性成体干细胞系。2.根据权利要求1所述的牛诱导扩展多能性成体干细胞的建系方法，其特征在于，所述外源基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、LIN28、Nanog、LRH1和RARG的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1
‑
8所示。3.根据权利要求1所述的牛诱导扩展多能性成体干细胞的建系方法，其特征在于：所述牛成纤维细胞培养液是在DMEM培养基中，添加10％FBS，1
×
谷氨酰胺，1
×
非必需氨基酸，1
×
青链霉素。4.根据权利要求1所述的牛诱导扩展多能性成体干细胞的建系方法，其特征在于，所述M15+DOX培养液是在DMEM培养基中，添加15％FBS、1
×
谷氨酰胺、1
×
非必需氨基酸、1
×
青链霉素及强力霉素Dox。5.根据权利要求1所述的牛诱导扩展多能性成体干细胞的建系方法，其特征在于，所述细胞因子培养液包括：(1)有效量的成纤维细胞生长因子或其等效物；(2)有效量的一种或多种Wnt信号通路抑制剂；(3)有效量的一种或多种GSK
‑
3α/β信号通路抑制剂；(4)有效量的一种或多种Lck/Src信号通路抑制剂；(5)有效量的Activin A蛋白或其等效物。6.根据权利要求5所述的牛诱导扩展多能性成体干细胞的建系方法，其特征在于，所述Wnt信号通路抑制剂为IWR
‑
1、XAV
‑
939、ICG
‑
001、Wnt
‑
C59、LGK
‑
974、LF3、CP21R7、NCB
‑
0846、PNU
‑
74654、SKL2001、KY02111、IWP
‑
2、IWP
‑
L6、FH535、WIKI4、PRI
‑
724、IQ
‑
l、KYA1797K、C59、ETC
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李喜和，赵丽霞，王子馨，
申请(专利权)人：内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：