一种中性纤维素酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种中性纤维素酶突变体及其在纺织领域中的应用。所述突变体在pH7.0

【技术实现步骤摘要】
一种中性纤维素酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程和蛋白质改造
，具体涉及一种中性纤维素酶突变体及其在纺织领域中的应用。

技术介绍

[0002]纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它不是单种酶，这组酶可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，使得纤维素转变为纤维二糖和葡萄糖，纤维素酶属于一种复杂的复合物，被称为纤维素酶系。它们之间相互发生协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。纤维素酶属于糖苷水解酶，传统上被分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶（即纤维二糖水解酶）和β-葡萄糖苷酶。
[0003]1906年，Seilliere在蜗牛的消化液中发现了纤维素酶，至今已有一百余年。随着工业的发展，纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。从20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球、脱毛以及增柔等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。
[0004]2014年，姚斌等筛选到Thielavia arenaria XZ7产生的一种45家族纤维素酶，其最适pH值为5.5，最适温度为60℃，在碱性条件下具有一定酶活力且耐碱性好，在90℃下处理1h保留最适条件70％左右的酶活力，沸水里处理1h后仍具有最适条件50％的酶活力，热稳定性非常好，可很好的应用于纺织领域。2016年，赖伟坚等提供了一种涉及亲本GH45纤维素酶的变体，该变体包含催化结构域和纤维素结合结构域，其中该纤维素酶结合结构域与该催化结构域是异源的，并且其中该变体与亲本GH45纤维素酶相比具有改进的纤维素纺织品生物整理活性。2019年，魏东芝公开了一种来源于深海真菌Phaeosphaeria sp.LH21的具有宽广pH活性纤维素酶，可广泛应用于在生物石洗、织物抛光、纸桨处理以及生物质的转变等方面。
[0005]纺织工业是传统意义上的高污染行业，在追求人与环境和谐相处的今天，寻找高效率、低污染的新型纺织技术成为了一个必须解决的难题。当今的服装潮流更是追求工艺低污染、面料纯天然、穿着舒适轻盈。生物技术发展至今其在各个工业领域的辅助作用是无可厚非的,而酶制剂的应用以其高效、低价、低污染的优势必将成为纺织行业等其他传统工业突破技术难题的优良辅助手段。纤维素酶在纺织工业上应用广泛，有着不可替代的优势
和良好的发展前景。因此，通过基因工程手段生产高效、低价、低污染的纤维素酶，是目前纺织行业亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种中性纤维素酶突变体及其在纺织领域中的应用。所述突变体在pH7.0-8.5范围内具有较高的酶活性，可广泛应用于纺织品的染整加工，提高对织物的除毛、起花效果，减少纤维素酶的用量，从而降低成本。
[0007]本专利技术一方面涉及一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶的第109位氨基酸由Ser突变为Asn。
[0008]本专利技术一方面涉及编码上述纤维素酶突变体的DNA分子。
[0009]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0010]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
[0012]将上述重组表达载体转入里氏木霉宿主细胞中进行重组表达，获得的纤维素酶突变体在pH7.0-8.5范围内具有更高的酶活力。
[0013]本专利技术还涉及上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
[0014]本专利技术提供的突变位点S109N可使纤维素酶SCD45的pH适用范围向中性和碱性条件偏移，显著提高其在pH7.0-8.5范围内的酶活水平。其中，纤维素酶SCD45的最适pH为6.0，而本专利技术提供的纤维素酶突变体NSCD45的最适pH为7.0；而且，在pH 8.5条件下，纤维素酶突变体NSCD45的酶活残留率为54.66%，而纤维素酶SCD45的酶活残留率仅为16.43%。所述纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点均匀；所述纤维素酶突变体NSCD45的用量仅为纤维素酶SCD45的59.2%，即可达到相同的除毛、水洗效果，能大大节约用酶成本，提高经济效益，取得了意料不到的技术效果。
附图说明
[0015]图1为SDS-PAGE电泳检测图；图2为纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45最适pH曲线；图3为纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45的除毛效果对比；图4为纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45的水洗效果对比。
具体实施方式
[0016]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0017]下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。
[0018]实施例1 纤维素酶突变体基因的获得及表达载体的构建1.1 纤维素酶突变体的获得为了提高纤维素酶SCD45（氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2）在中性条件下的酶活力，申请人通过定向进化技术对该酶活性位点附近的氨基酸进行了大量突变的筛选。
[0019]设计PCR引物NcE-F1、NcE-R1如下：NcE-F1： GGCGAATTCGCCGATGGCAAGTCGACC （下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；NcE-R1：ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGGTACCAG（下划线为限制性内切酶NotI识别位点）。
[0020]以纤维素酶SCD45基因（SEQ ID NO: 2）为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶的第109位氨基酸由Ser突变为Asn。2.编码权利要求1所述的纤维素酶突变体的DNA分子。3.一种重组表达载体，包含权利要求2所述的DNA分子。4.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：田延军，吴秀秀，刘艳萍，张青，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：