一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶-7活性的方法技术

本发明专利技术提供一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶

【技术实现步骤摘要】
一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶
‑
7活性的方法


[0001]本专利技术属于酶检测
，具体涉及一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶
‑
7活性的方法。

技术介绍

[0002]基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)是一类由细胞分泌的锌离子依赖性内肽酶的总称，能够降解细胞外基质蛋白和基底膜的主要成分，从而参与一系列重要的生理和病理过程。MMPs在调节细胞黏附、胚胎发育、骨重建和创伤修复等生理过程起着重要作用。目前已经发现了二十多种人源MMPs，其中MMP
‑
7是一种最小的MMPs，在正常生理条件下表达水平很低，开发MMP
‑
7活性的检测方法具有重要意义。
[0003]荧光分析法具有灵敏度高、操作简便、检测快速、选择性好等优势，在生物分析中具有广泛应用。常用的荧光物质主要包括有机荧光探针(罗丹明类、花菁类等)和纳米荧光探针(量子点、贵金属纳米簇等)。虽然荧光检测具有很多优点，但容易受外部环境、光漂白、探针负载和留存等因素的影响，而降低结果的精确性。比率荧光法的出现正好克服了这一缺点，它是以两个不同波长处的荧光强度的比值作为响应信号来对检测物进行定量，不受光源强度和仪器灵敏度的影响，有利于提高检测的灵敏度和动态范围。因而，构建比率型荧光探针用于MMP
‑
7活性的检测表现出巨大潜力。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶
‑
7活性的方法，该探针能够有效对金属蛋白酶
‑
7(MMP
‑
7)活性进行检测。
[0005]本专利技术首先提供一种比率型荧光纳米探针的制备方法，包括：
[0006]步骤一：通过溶剂热法制备MnFe2O4纳米粒子；
[0007]步骤二：将步骤一的MnFe2O4纳米粒子与DIB
‑
PEG
‑
NH2混合搅拌后得到氨基聚乙烯乙二醇包裹的铁酸锰纳米粒子MnFe2O4‑
PEG
‑
NH2；
[0008]步骤三：将FITC
‑
pep和RhB
‑
pep混合后加入NHS和EDC活化，再加入步骤二得到的MnFe2O4‑
PEG
‑
NH2搅拌，得到比率型荧光纳米探针MnFe2O4‑
pep
‑
dyes。
[0009]优选的是，所述的步骤一MnFe2O4纳米粒子尺寸为18～22nm。
[0010]优选的是，所述的步骤二中MnFe2O4纳米粒子与DIB
‑
PEG
‑
NH2的质量比为1:1。
[0011]优选的是，所述的步骤二的混合搅拌温度为20～25℃，时间为4h。
[0012]优选的是，所述的FITC
‑
pep、RhB
‑
pep、MnFe2O4‑
PEG
‑
NH2的质量比为0.25～4:1:20，NHS和EDC的浓度分别为5mmol L
‑1和2mmol L
‑1。
[0013]优选的是，所述的FITC
‑
pep序列为FITC
‑
Gly
‑
Asn
‑
Gly
‑
Arg
‑
Gly
‑
Lys
‑
Gly
‑
Lys
‑
Val
‑
Pro
‑
Leu
‑
Ser
‑
Leu
‑
Thr
‑
Met
‑
Gly
‑
Cys，RhB
‑
pep序列为Rhodamine B
‑
Gly
‑
Asn
‑
Gly
‑
Arg
‑
Gly
‑
Lys
‑
Gly
‑
Cys。
[0014]优选的是，所述的步骤三的活化温度为20～25℃，时间为2h。
[0015]优选的是，所述的步骤三的搅拌温度为20～25℃，时间为24h。
[0016]本专利技术还提供上述制备方法得到的比率型荧光纳米探针。
[0017]本专利技术提供一种基于上述比率型荧光纳米探针定量检测MMP
‑
7活性的方法，其包括如下步骤：
[0018]将比率型荧光纳米探针MnFe2O4‑
pep
‑
dyes与不同浓度的MMP
‑
7在37℃
[0019]下共同孵育，所述的孵育时间为100～150min，进行荧光光谱测试，分别在激发波长为490nm和550nm条件下，测试FITC和RhB的荧光光谱；通过计算得到MMP
‑
7浓度和I
FITC
/I
RhB
的关系式，如下：
[0020]I
FITC
/I
RhB
＝0.0459C
‑
0.0174；
[0021]式中：C为MMP
‑
7浓度，单位为nmol/L，I
FITC
为测试样在490nm处的
[0022]荧光强度值，I
RhB
为测试样在550nm处的荧光强度值，线性相关系数为0.998。
[0023]本专利技术的有益效果
[0024]本专利技术提供一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶
‑
7活性的方法，采用溶剂热法制备MnFe2O4纳米粒子，再在其表面包裹上一层氨基修饰聚乙烯乙二醇，将其从疏水性转变成亲水性，用于底物多肽FITC
‑
pep和靶向多肽RhB
‑
pep的连接，将MMP
‑
7的底物多肽(FITC
‑
pep)和靶向多肽(RhB
‑
pep)末端的羧基活化后，通过与MnFe2O4‑
PEG
‑
NH2的氨基发生席夫碱反应，从而连接到纳米粒子表面，得到比率型荧光纳米探针MnFe2O4‑
pep
‑
dyes，由于MnFe2O4的吸收光谱和FITC的荧光发射光谱发生重叠，而与RhB的荧光发射光谱重叠较少，导致FITC的荧光被淬灭，RhB的荧光几乎不受影响。当底物多肽FITC
‑
pep被MMP
‑
7剪切后，FITC从纳米粒子表面脱离，导致其荧光恢复。根据FITC和RhB的荧光强度比值(I
FITC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种比率型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括：步骤一：通过溶剂热法制备MnFe2O4纳米粒子；步骤二：将步骤一的MnFe2O4纳米粒子与DIB
‑
PEG
‑
NH2混合搅拌后得到氨基聚乙烯乙二醇包裹的铁酸锰纳米粒子MnFe2O4‑
PEG
‑
NH2；步骤三：将FITC
‑
pep和RhB
‑
pep混合后加入NHS和EDC活化，再加入步骤二得到的MnFe2O4‑
PEG
‑
NH2搅拌，得到比率型荧光纳米探针MnFe2O4‑
pep
‑
dyes。2.根据权利要求1所述的一种比率型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤一MnFe2O4纳米粒子尺寸为18～22nm。3.根据权利要求1所述的一种比率型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中MnFe2O4纳米粒子与DIB
‑
PEG
‑
NH2的质量比为1:1。4.根据权利要求1所述的一种比率型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤二的混合搅拌温度为20～25℃，时间为4h。5.根据权利要求1所述的一种比率型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的FITC
‑
pep、RhB
‑
pep、MnFe2O4‑
PEG
‑
NH2的质量比为0.25～4:1:20，NHS和EDC的浓度分别为5mmol L
‑1和2mmol L
‑1。6.根据权利要求1所述的一种比率型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的FITC
‑
pep序列为FITC
‑
Gly
‑
Asn
‑
Gly
‑
Arg
‑
Gly
‑
Lys
‑
Gly
‑
Lys
‑
Val

【专利技术属性】
技术研发人员：王振新，陈宏达，张婳，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：