电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒及其应用。所采用的电化学法检测尿液中的总胆汁酸试剂盒包含试剂：磷酸盐缓冲溶液、3α

【技术实现步骤摘要】
电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于电化学检测领域，主要涉及一种电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]胆汁酸是一类24碳胆烷酸，以胆固醇为原料、在肝脏中合成。胆汁酸具有重要的生理功能，不仅能促进脂肪的消化、吸收，还可以作为信号分子激活多种受体，介导多种信号调节通路，在人体的葡萄糖、脂肪、自身代谢及能量代谢中发挥重要作用。肝脏疾病时肝细胞受损可引起胆汁酸合成及排泄障碍，胆汁酸的合成明显减少。肝细胞摄取胆汁酸功能障碍，使胆汁酸从血中的清除速率减慢，导致血液和尿液中的胆汁酸含量增高。血清胆汁酸是临床生化常规检测项目，其浓度变化可敏感地反映肝脏功能。研究表明尿液胆汁酸与血清胆汁酸水平有较强的相关性。由于尿液标本无需有创操作即可获得，因此，尿液胆汁酸可以代替血清胆汁酸作为无创、实时监测肝胆疾病的指标。
[0003]目前，临床主要通过酶循环法测定总胆汁酸，其原理是胆汁酸在3α
‑
羟基类固醇脱氢酶(3α
‑
HSD)和Thio
‑
NAD
+
作用下生成3α
‑
酮类固醇及Thio
‑
NADH。新生成的3α
‑
酮类固醇在3α
‑
HSD及NADH的作用下生成胆汁酸及NAD
+
。这样，微量胆汁酸检测信号在多次酶循环过程中被放大，同时使生成的Thio
‑
NADH扩增，通过测定Thio
‑
>NADH的吸光度值变化可求得胆汁酸含量。该方法在临床应用较广泛，但其检测灵敏度在μmol/L级，尚有待提高，且用于检测的专用仪器价格昂贵、体积较大。
[0004]电化学分析法是根据待测物在溶液中的电化学性质，通过电流、电位和电阻等参数与待测物浓度之间的关系，对待测物实现定性和定量分析。用电化学法测定尿液总胆汁酸具有如下优点：操作简便、可移动性强、检测速度快、试剂盒样品用量少、灵敏度高、选择性好等。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种灵敏度高、使用方便的尿液总胆汁酸检测试剂盒及其应用。
[0006]本专利技术的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒的原理为：在丝网印刷碳电极(SPCE)的工作电极表面加入含有3α
‑
羟基类固醇脱氢酶(3α
‑
HSD)、氧化型辅酶Ⅰ(NAD
+
)和三联吡啶钌(Ru(bpy)
32+
)的磷酸盐缓冲液。再施加一定的氧化恒电位，溶液中的Ru(bpy)
32+
在电极表面被氧化为Ru(bpy)
33+
，待基线稳定后加入待测尿液样本，3α
‑
HSD特异性催化尿液中的胆汁酸生成3α
‑
酮类固醇和NADH。NADH在电极表面失去电子被氧化生成NAD
+
，同时Ru(bpy)
33+
被还原成Ru(bpy)
32+
。一定电位条件下，Ru(bpy)
32+
在电极表面再次被氧化为Ru(bpy)
33+
，从而产生电化学信号，故能在I
‑
t曲线上对尿液中总胆汁酸含量进行间接电化学定量分析。
[0007]本专利技术所述的SPCE包括一印制电极的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基片、PET基片上的外部绝缘膜和基片上的导线接口。其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，分别
为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极。三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下印制的导线与接口相连。所述SPCE用超纯水冲洗干净，于室温下晾干备用。
[0008]其中，更优的，所述检测混合液中3α
‑
HSD的活度为1.2kU/L，所述Ru(bpy)
32+
的浓度为7mmol/L，所述NAD
+
的浓度为8mmol/L，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50.0mmol/L，pH值为8.5，所述检测电位为1.20V。
[0009]其中，所述磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)由0.1mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L磷酸钠溶液混合而配制。
[0010]1.本专利技术所述电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒的具体使用方法如下：
[0011]1)样品预处理：分别取10μL尿液和990μL超纯水加入1.5mL E
P
管中涡旋混匀，得到一次稀释的尿液样品；再分别取一次稀释的尿液样品10μL和990μL超纯水加入1.5mL E
P
管中涡旋混匀，得到二次稀释的尿液样品；
[0012]2)分别取8μL 100.0mmol/L NAD
+
，12μL 10.0kU/L 3α
‑
HSD，7μL 100.0mmol/L Ru(bpy)
32+
，23μL超纯水和50μL 100.0mmol/L PBS溶液，pH值为8.5，混合配制成检测液；
[0013]3)将步骤2)得到的检测液50μL滴加到SPCE工作区域，所述SPCE与电化学工作站相连。在恒电位下进行电流
‑
时间(I
‑
t)曲线分析，至基线恒定时加入步骤1)得到的5.0μL待测尿液样品于所述工作电极表面，通过计算I
‑
t曲线中增加的峰电流，从而对待测尿液样品中的总胆汁酸含量进行间接定量测定，恒电位参数设置为1.20V。
[0014]2.本专利技术所述电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒有益效果如下：
[0015]1)本专利技术所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒，通过使用丝网印刷碳电极配合电化学工作站对尿液总胆汁酸进行定量测定，检测仪器操作简单、价格低廉；
[0016]2)本专利技术所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒中所用的丝网印刷电极，制作成本低廉，制作过程简单、快速，可实现批量生产，SPCE为一次性使用电极，既能避免传统柱电极打磨抛光的时间精力损耗，又能有效避免柱电极重复使用过程中可能造成的实验交叉污染问题；
[0017]3)本专利技术所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒，仅需稀释处理即可消除尿液样本的基质干扰，操作简便、快速；
[0018]4)本专利技术所述的电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，响应快速、灵敏度高，具有较好的重复性和准确度，可对尿液中的总胆汁酸进行快速、准确定量；
[0019]5)本专利技术所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒能实现尿液中的总胆汁酸含量测定，可以在无创条件下监测患者的尿液胆汁酸水平，辅助临床诊断肝胆疾病。
附图说明
[0020]图1为本专利技术所述尿液总胆汁酸电化学法检测原理示意图。
[0021]图2为本专利技术中氧化峰电流对尿液总胆汁酸浓度的标准曲线图。
[0022]图3为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，其特征在于：包括3α
‑
羟基类固醇脱氢酶(3α
‑
HSD)、氧化型辅酶Ⅰ(NAD
+
)、三联吡啶钌(Ru(bpy)
32+
)、磷酸盐缓冲液和丝网印刷电极(SPCE)。2.根据权利要求1所述的电化学检测尿液总胆汁酸试剂盒，其中，所述丝网印刷电极包括——印制电极的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基片、PET基片上印制的外部绝缘层和基片上一端的导线接口，其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，分别为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极，三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下印制的导线与接口相连。3.根据权利要求1所述的电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，其中，所述3α
‑
HSD的活度为10kU/L。4.根据权利要求1所述的电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，其中，所述NAD
+
的浓度为100.0mmol/L。5.根据权利要求1所述的电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，其中，所述Ru(bpy)
32+
的浓度为100.0mmol/L。6.根据权利要求1所述的电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为100.0mmol/L，pH值为8.5。7.根据权利要求6所述的电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer sa...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓清，李彦茹，丁敏，吕文静，朱阳，宋紫苹，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：