一种SNaPshot多重分析系统的构建方法技术方案

本发明专利技术涉及一种SNaPshot多重分析系统的构建方法，包括多重PCR反应系统的构建、SNaPshot反应系统的构建、SNaPshot产物纯化系统构建、上机体系的构建以及结果分析；多重PCR反应系统的构建包括以下步骤：根据待测基因的SNP位点序列信息设计多重PCR引物，并确定各引物的最低退火温度，作为反应程序关键参数；采用基础单独PCR反应体系和程序、基础多重PCR反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增；若单独PCR中有位点未被扩增，则重新设计该位点的多重PCR引物并重复上述操作；若单独PCR中位点均被扩增，则调整多重PCR反应体系和程序保证不同条带亮度一致。本发明专利技术通过建立快速简单的SNaPshot多重分析检测流程来检测SNP相关项目，检测效率高，成本低。成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种SNaPshot多重分析系统的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，尤其是涉及一种SNaPshot多重PCR设计方法及多重分析系统的构建方法。

技术介绍

[0002]测序技术是分子生物学最重要的检测手段，是基因多态性和基因突变检测的金标准，也是其他众多技术方法的参考标准。测序技术的优势在于，直接测定样本的基因序列，得到基因变异的精确情况，并且能够对某一段DNA序列进行多位点突变检测，或未知突变检测，广泛应用在肿瘤靶向药物个体化治疗检测、遗传疾病基因突变检测、血液病基因突变检测、HLA分型与配型、病原微生物耐药性检测等等诸多领域。第一代DNA测序技术用的是1975年由Sanger和CoμLson开创的链终止法或Maxam和Gilbert专利技术的化学法(链降解)。其中常用的Sanger测序(双脱氧末端终止法)的原理是将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'
‑
OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这样的PCR产物与普通PCR不一样，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。它们具有共同的起始点，终止在不同的的核苷酸上，每一个碱基都有相同的概率被终止。将得到的不同大小的片段进行毛细管电泳，通过对荧光信号的采集和拼接，最终获得目的片段的序列。其特点是高读长；检测通量中的；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序，广泛应用于临床检测和科研研究。
[0003]SNaPshot多重分析系统又称为小测序技术，是一种基于引物单碱基延伸的方法，在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多态位点5
’
端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。SNaPshot多重分析系统能够对多个SNP进行多重分析，可用于筛选和验证SNP，能通过简单快速的检测流程来检测SNP相关项目，提高检测效率，降低检测成本。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种SNaPshot多重分析系统的构建方法，建立快速简单的检测流程来检测SNP相关项目，提高检测效率，降低检测成本。
[0005]本专利技术通过以下技术方案来实现上述技术目的：
[0006]本专利技术提供一种SNaPshot多重分析系统的构建方法，包括多重PCR反应系统的构建、SNaPshot反应系统的构建、SNaPshot产物纯化系统构建、上机体系的构建以及结果分析；
[0007]多重PCR反应系统的构建包括以下步骤：
[0008]根据待测基因的SNP位点序列信息设计多重PCR引物，并确定各引物的最低退火温度，作为反应程序关键参数；
[0009]采用基础单独PCR反应体系和程序、基础多重PCR反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增；
[0010]若单独PCR中有位点未被扩增，则重新设计该位点的多重PCR引物并重复上述操作；
[0011]若单独PCR中位点均被扩增，则调整多重PCR反应体系和程序保证不同条带亮度一致。
[0012]作为本专利技术的一种实施方式，多重PCR反应系统的构建中，基础单独PCR反应体系为：10
×
Buffer 1μL、dNTP 0.4μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、Taq
‑
酶0.4μL、ddH2O 6.5μL、样本DNA模板1μL；
[0013]基础单独PCR反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循环，72℃10min；
[0014]基础多重PCR反应体系为：
[0015]ddH2O3μL多重PCR扩增引物工作液1μL样品DNA1μL2*Vazyme mix5μLTotal10μL
[0016]其中，多重PCR扩增引物工作液中各正反引物均为0.5μM；
[0017]基础多重PCR反应程序为：
[0018][0019]作为本专利技术的一种实施方式，多重PCR反应系统的构建中，多重PCR反应体系的调整包括引物浓度的调整和模板浓度的调整；和/或
[0020]多重PCR反应程序的调整包括退火温度的调整。
[0021]作为本专利技术的一种实施方式，SNaPshot反应系统的构建包括以下步骤：
[0022]根据待测基因的SNP位点序列信息设计测序引物；
[0023]采用基础单独PCR反应体系和程序、基础SNaPshot反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带扩增；
[0024]若单独PCR中有位点未被扩增，则重新设计该位点的测序引物并重复上述操作；
[0025]若单独PCR中位点均被扩增，则调整SNaPshot反应体系和程序至保证所有位点均被扩增。
[0026]作为本专利技术的一种实施方式，SNaPshot反应系统的构建中，基础单独PCR反应体系为：10
×
Buffer 1μL、dNTP 0.4μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、Taq
‑
酶0.4μL、ddH2O 6.5μL、样本DNA模板1μL
[0027]基础单独PCR反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循
环，72℃10min；
[0028]基础SNaPshot反应体系为：
[0029]ddH2O1μL多重PCR测序引物工作液1μL多重PCR纯化产物3μLSNaPshot mix5μLTotal10μL
[0030]其中，多重PCR测序引物工作液各引物终浓度均为0.001μM；
[0031]基础SNaPshot反应程序为：
[0032][0033]作为本专利技术的一种实施方式，SNaPshot反应体系的调整包括测序引物浓度和模板的调整；和/或
[0034]SNaPshot反应体系程序的调整包括退火温度的调整。
[0035]作为本专利技术的一种实施方式，纯化体系的构建包括以下步骤：
[0036]采用基础纯化体系和程序对SNaPshot反应系统扩增后的产物进行上机检测，若纯化产物上机后存在杂峰，则调整纯化反应体系和程序至无杂峰。
[0037]作为本专利技术的一种实施方式，还包括PCR产物酶解系统的构建，所述酶解反应体系的构建位于多重PCR反应系统的构建和SNaPshot反应系统的构建之间。
[0038]作为本专利技术的一种实施方式，PCR产物酶解系统的构建包括以下步骤：
[0039]采用基础酶解反应体系和程序对多重PCR产物进行酶解；
[0040]若酶解产物上机后存在杂峰，则调整酶解纯化体系和程序。
[0041]本专利技术的另一目的在于提供一种SNaPshot多重分析系统，采用上述的构建方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SNaPshot多重分析系统的构建方法，其特征在于，包括多重PCR反应系统的构建、SNaPshot反应系统的构建、SNaPshot产物纯化系统构建、上机体系的构建以及结果分析；多重PCR反应系统的构建包括以下步骤：根据待测基因的SNP位点序列信息设计多重PCR引物，并确定各引物的最低退火温度，作为反应程序关键参数；采用基础单独PCR反应体系和程序、基础多重PCR反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增；若单独PCR中有位点未被扩增，则重新设计该位点的多重PCR引物并重复上述操作；若单独PCR中位点均被扩增，则调整多重PCR反应体系和程序保证不同条带亮度一致。2.根据权利要求1所述的SNaPshot多重分析系统的构建方法，其特征在于，多重PCR反应系统的构建中，基础单独PCR反应体系为：10
×
Buffer 1μL、dNTP 0.4μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、Taq
‑
酶0.4μL、ddH2O 6.5μL、样本DNA模板1μL；基础单独PCR反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循环，72℃10min；基础多重PCR反应体系为：ddH2O3μL多重PCR扩增引物工作液1μL样品DNA1μL2*Vazyme mix5μLTotal10μL其中，多重PCR扩增引物工作液中各正反引物均为0.5μM；基础多重PCR反应程序为：3.根据权利要求1所述的SNaPshot多重分析系统的构建方法，其特征在于，多重PCR反应系统的构建中，多重PCR反应体系的调整包括引物浓度的调整和模板浓度的调整；和/或多重PCR反应程序的调整包括退火温度的调整。4.根据权利要求1所述的SNaPshot多重分析系统的构建方法，其特征在于，SNaPshot反应系统的构建包括以下步骤：根据待测基因的SNP位点序列信息设计测序引物；采用基础单独PCR反应体系和程序、基础SNaPshot反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带扩增；若单独PCR中有位点未被扩增，则重新设计该位点的测...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽琼，徐海霞，郝玮，李小青，
申请(专利权)人：武汉康圣达医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：