检测核酸分子中N6-甲基腺嘌呤的方法及试剂盒技术

本申请提供了一种检测核酸分子中N6

【技术实现步骤摘要】
检测核酸分子中N6
‑
甲基腺嘌呤的方法及试剂盒
[0001]本申请是以CN申请号为202110655085.7，申请日为2021年6月11日的申请为基础，并主张其优先权，该CN申请的公开内容在此作为整体引入本申请中。


[0002]本申请涉及分子生物学领域，特别是核酸检测和分析领域。特别地，本申请提供了一种检测核酸分子中N6
‑
甲基腺嘌呤的方法。此外，本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于实施本申请的方法。

技术介绍

[0003]高通量测序技术的发展，对研究表观遗传学修饰的生物学功能具有重要意义。目前，对于N6
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甲基腺嘌呤(N6
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methyladenosine，m6A)修饰，已经开发了多种测序方法。其中，MeRIP
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seq(即m6A
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seq)是目前应用最广泛的m6A全转录组水平的测序方法，该方法利用m6A特异性的抗体富集含有m6A的RNA片段，继而进行测序分析，分辨率在200nt左右。miCLIP结合抗体交联和免疫沉淀，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测核酸分子中N6
‑
甲基腺嘌呤的方法，其包括以下步骤：(1)对待测核酸分子中鸟嘌呤的氨基进行保护，得到被保护的核酸分子；(2)在羰基化合物的存在下，使被保护的核酸分子与亚硝酸盐反应，将待测核酸分子中的腺嘌呤转化为次黄嘌呤；(3)任选地，对步骤(2)中所得产物进行脱保护；(4)对前一步骤所得产物进行检测。2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，使用第二羰基化合物对待测核酸分子中鸟嘌呤的氨基进行保护；优选地，所述羰基化合物源自：(i)步骤(1)中添加的第二羰基化合物；(ii)步骤(2)中添加的第一羰基化合物；或者，(iii)(i)和(ii)的组合；优选地，所述第二羰基化合物与第一羰基化合物相同或不相同；更优选地，所述第二羰基化合物与第一羰基化合物相同；优选地，所述步骤(2)不包含添加第一羰基化合物的步骤，且所述羰基化合物源自：步骤(1)中添加的第二羰基化合物；或者，步骤(2)包含添加第一羰基化合物的步骤，且，所述第一羰基化合物与所述第二羰基化合物相同或者不同；优选地，步骤(3)中，任选地对所述产物中的鸟嘌呤进行脱保护；优选地，所述第一羰基化合物与第二羰基化合物各自独立地选自式I所示化合物及其任意组合，其中R1为醛基、C1‑3烷基(例如甲基、乙基或正丙基)或卤素取代的C1‑3烷基(例如三氯甲基、三氟甲基)，R2为H、C1‑3烷基(例如甲基、乙基或正丙基)、苯基或HC(＝O)
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CH(Br)
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；或者R1和R2与它们所连接的羰基形成环状结构，例如茚三酮；优选地，所述第一羰基化合物与第二羰基化合物各自独立地选自：乙二醛、2,3
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丁二酮、茚三酮、2
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溴丙二醛、丙酮醛、三氯乙醛、苯基乙二醛及其任意组合；优选地，所述第一羰基化合物选自：乙二醛、2,3
‑
丁二酮、茚三酮、2
‑
溴丙二醛、丙酮醛、三氯乙醛、苯基乙二醛及其任意组合；优选地，所述第一羰基化合物为选自乙二醛、2
‑
溴丙二醛、2,3
‑
丁二酮、苯基乙二醛、三氯乙醛、茚三酮及其任意组合；优选地，所述第二羰基化合物选自：乙二醛、茚三酮及其任意组合。3.权利要求2所述的方法，其中，步骤(1)中，使待测核酸分子与第二羰基化合物在第一溶剂中接触；优选地，所述第一溶剂为水；优选地，步骤(1)中，使待测核酸分子与第二羰基化合物在第一溶剂中，并且在二甲基
亚砜(DMSO)或N,N
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二甲基甲酰胺(DMF)的存在下接触；优选地，步骤(1)中，使待测核酸分子与第二羰基化合物在第一溶剂中，并且在二甲基亚砜(DMSO)和硼酸或其盐(例如硼酸钾)的存在下接触；优选地，步骤(1)中，使待测核酸分子与第二羰基化合物在第一溶剂中，并且在N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)和硼酸或其盐(例如硼酸钾)的存在下接触；优选地，所述二甲基亚砜(DMSO)的终浓度为20v/v％～90v/v％，例如约30v/v％、约40v/v％、约50v/v％、约60v/v％、约70v/v％、约80v/v％；优选地，所述硼酸或其盐(例如硼酸钾)的终浓度为5mM～150mM(例如5mM～10mM，10mM～50mM，50mM～80mM，80mM～100mM)；优选地，所述第二羰基化合物的终浓度为大于或等于20mM，优选为20mM～3M(例如20mM～100mM，100mM～500mM，500mM～1000mM，1M～1.5M，1.5～2M，2M～2.6M，例如约0.8M、1.3M、1.8M)；优选地，步骤(1)中，使待测核酸分子与第二羰基化合物在16
‑
60℃(例如约20℃、约25℃、约30℃、约35℃，约40℃、约45℃、约50℃、约55℃)的温度条件下接触；优选地，步骤(1)中，使待测核酸分子与第二羰基化合物在16
‑
60℃(例如约20℃、约25℃、约30℃、约35℃，约40℃、约45℃、约50℃、约55℃)的温度条件下接触15
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60min(例如约20min、约30min、约40min、约50min)。4.权利要求1
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3任一项所述的方法，其中该方法还包括：在步骤(1)之前，对待测核酸分子进行预处理的步骤；优选地，所述预处理包括对待测核酸分子进行纯化、片段化、变性、或其任意组合；优选地，所述预处理包括使用甲酰胺水溶液或碱溶液对待测核酸分子进行变性。5.权利要求1
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4任一项所述的方法，其中，在步骤(2)中，在羰基化合物的存在下，使被保护的核酸分子与亚硝酸盐在第二溶剂中反应；优选地，所述第二溶剂为水、对甲苯磺酸水溶液、磷酸水溶液、2
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(N
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吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液、醋酸钠缓冲液、3
‑
(N
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吗啡啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液、哌嗪
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1,4
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二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4
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羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPPS)缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液或其任意组合；优选地，所述第二溶剂为对甲苯磺酸水溶液、磷酸水溶液、2
‑
(N
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吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液或醋酸钠缓冲液；优选地，所述第二溶剂为pH为4.5～6.5(例如5～6)的对甲苯磺酸水溶液；优选地，所述第二溶剂为pH为4.5～6.5(例如5～6)的磷酸水溶液；优选地，所述第二溶剂为2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液，其中2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸(MES)的终浓度为20mM～750mM(例如约40mM、约80mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约500mM)；优选地，所述第二溶剂为醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠的终浓度为300mM～400mM；优选地，步骤(2)中，在羰基化合物的存在下，使被保护的核酸分子与亚硝酸盐在第二溶剂中，并且在硼酸或其盐(例如硼酸钾)的存在下反应；优选地，所述第二溶剂中羰基化合物总摩尔浓度(终浓度)为大于或等于50mM，例如大于或等于250mM(例如50
‑
2000mM，50
‑
200mM,200
‑
500mM,500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1400mM，1400
‑
1800mM，1800
‑
2000mM，例如105mM)；优选地，所述第二溶剂含有终浓度为50
‑
2000mM(例如50
‑
200mM,200
‑
500mM,500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1400mM，1400
‑
1800mM，1800
‑
2000mM，例如105mM)的乙二醛和终浓度为50
‑
1500mM(例如50
‑
60mM,60
‑
100mM，100
‑
300mM，300
‑
600mM,600
‑
800mM，800
‑
1200mM，1200
‑
1500mM)的丙酮醛；优选地，所述第二溶剂含有终浓度为50
‑
2000mM(例如50
‑
200mM,200
‑
500mM,500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1400mM，1400
‑
1800mM，1800
‑
2000mM，例如105mM)的乙二醛和终浓度为50
‑
2500mM(例如50
‑
100mM,100
‑
200mM,200
‑
500mM，500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1500mM，1500
‑
1800mM，1800
‑
2200mM，2200
‑
2500mM)的2,3
‑
丁二酮；优选地，所述第二溶剂含有终浓度为50
‑
2000mM(例如50
‑
200mM,200
‑
500mM,500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1400mM，1400
‑
1800mM，1800
‑
2000mM，例如105mM)的乙二醛和终浓度为20
‑
1500mM(例如20
‑
100mM,100
‑
200mM,200
‑
500mM，500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1500mM)的茚三酮；优选地，所述第二溶剂含有终浓度为50
‑
2000mM(例如50
‑
200mM,200
‑
500mM,500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1400mM，1400
‑
1800mM，1800
‑
2000mM，例如105mM)的乙二醛和终浓度为50
‑
1500mM(例如50
‑
100mM,100
‑
200mM,200
‑
400mM,400
‑
500mM，500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1500mM)的2
‑
溴丙二醛；优选地，所述第二溶剂含有终浓度为50
‑
2000mM(例如50
‑
200mM,200
‑
500mM,500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
‑
1400mM，1400
‑
1800mM，1800
‑
2000mM，例如105mM)的乙二醛和终浓度为50
‑
1500mM(例如50
‑
100mM,100
‑
400mM,400
‑
500mM，500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
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1500mM)的三氯乙醛；优选地，所述第二溶剂含有终浓度为50
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2000mM(例如50
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200mM,200
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500mM,500
‑
800mM，800
‑
1200mM,1200
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1400mM，1400
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1800mM，1800
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2000mM，例如105mM)的乙二醛和终浓度为50
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1500mM(例如50
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100mM,100
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400mM,400
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500mM，500
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800mM，800
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1200mM,1200
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1500mM)的苯基乙二醛；优选地，所述第二溶剂含有终浓度大于或等于50mM，例如大于或...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊成器，王晶，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：