一种采用单标签进行相对定量的mNGS病原检测方法技术

本发明专利技术公开了一种采用单标签进行相对定量的mNGS病原检测方法，向不同样本中添加同一种特定的等量的单标签，该单标签为来自于某种微生物的一段与人类基因组无匹配的核酸序列，通过该单标签在不同样本中测序后的检出数与添加量的对应关系，对不同样本中人源序列的检出条数进行校正，即均一化。均一化后的数据可在同一水平线比较不同样本间病原菌检出情况，对同批次或同一待研究范围内临床样本的病原菌检出数目相对定量。菌检出数目相对定量。

【技术实现步骤摘要】
一种采用单标签进行相对定量的mNGS病原检测方法


[0001]本专利技术涉及生物基因检测技术，具体说，是一种采用单标签进行相对定量的mNGS病原检测方法。

技术介绍

[0002]自2005年开发二代测序（NGS）技术以来，宏基因组方法在二代测序中的使用频率大大增加。宏基因组测序（mNGS）是一种不需进行病原微生物培养即可快速深入鉴定感染病原体的新技术，相比传统培养方法拥有更高敏感性的同时又与“精准诊疗”的理念相契合，mNGS是临床病毒学中有效的重要工具（Mokili JL, Rohwer F, Dutilh BE. Metagenomics and future perspectives invirus discovery. Curr Opin Virol. 2012, 2:63
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77）。
[0003]mNGS可以立即获得完整的病毒遗传信息，从而进行病毒流行病学监测或鉴定病毒耐药性特定突变（Prachayangprecha S, Schapendonk CME, Koopmans MP, Osterhaus ADME, Sch
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rch AC, Pas SD, et al. Exploring the potential of next
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generation sequencing in detection of respiratory viruses. J Clin Microbiol. 2014, 52:3722
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30），能够鉴定高度不同的病毒基因组、罕见的病原体，并发现靶向PCR遗漏的病毒（Graf EH, Simmon KE, Tardif KD, Hymas W, Flygare S, Eilbeck K, et al.Unbiased detection of respiratory viruses by use of RNA sequencing
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based metagenomics: a systematic comparison to a commercial PCR panel. J Clin Microbiol. 2016, 54:1000
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7），使用mNGS进行宏基因组学分析是确定病毒感染丰度并以无偏好性的方式鉴定感染的有效方法（Lefterova MI, Suarez CJ, Banaei N, Pinsky BA. Next
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generationsequencing for infectious disease diagnosis and management: a reportof the Association for Molecular Pathology. J Mol Diagn. 2015, 17:623
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634）。
[0004]目前mNGS技术临床采集样本类型根据不同病灶主要分为静脉血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液及其他体液、组织等，临床样本采集对象为人类样本，含有大量人类基因组信息，对mNGS的病原菌或其他微生物的测序结果产生较大影响。针对此问题，多数检验所机构采取对临床样本提取核酸前进行前处理操作，以期去除部分宿主信息（即人类核酸），提升病原菌的检出比例。
[0005]但由于临床样本采集部位、样本间个体差异导致样本复杂性极高，各样本类型间的宿主比例不尽相同，统一进行的去宿主前处理操作效果也不尽相同。这导致了不同样本间测序数据中宿主所占比例无法处于同一水平，对于同批次不同样本类型间病原菌检出情况无法在同一水平线进行比较，临床相关研究中样本间的病原菌检出无法相对量化，宿主比例的无法均一化大大影响了临床样本研究数据的真实性和可靠性。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是，通过向样本中添加一种特定的单标签的方法以达
成对同批次或同一待研究范围内临床样本的病原菌检出数目相对定量的效果。即向待比较范围内的所有临床样本均添加等量的同一来源的单标签，该标签可为来自于某种微生物的一段核酸序列，需满足与人类基因组无匹配；以该单标签作为标志物，对检出数据中来自人源的序列检出条数进行校正，因该单标签的添加量保持恒定，因此通过该单标签在不同样本中的检出数即可对不同样本中人源的序列检出条数均一化，以达成在同一水平线比较不同样本间病原菌检出情况的目的。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种采用单标签进行相对定量的mNGS病原检测方法，包括以下步骤：步骤1：制备单标签：单标签采用人工合成或购买已选择的菌株，菌株浓度为100μg/mL，按预估使用量分装至不同的1.5 mL EP管中，保存在
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80℃冰箱；步骤2：mNGS样本中单标签的添加：临床样本收录后，样本按照单次提取用量分装至2.0 mL EP管中，取出分装好的单标签，室温化冻，彻底融化后置于涡旋震荡仪上震荡混匀，8000 rpm/min转速下离心30 sec，每个样本中添加10 μl离心好的单标签，混匀后进行核酸提取和mNGS文库构建；步骤3：测序数据均一化标准化：设定1μg单标签在无人源宿主影响条件下理论检出reads数为n；均一化指数=n/临床样本中单标签实际检出reads数；均一化后某病原菌检出数=均一化指数
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下机数据中某病原菌检出reads数；步骤4：根据均一化后某病原菌检出数的数值，完成不同样本间某一病原菌的相同水平横向比较。
[0008]优选，所述单标签的选择满足以下条件：一、单标签为已知序列或已知来源的核酸片段，或为已知序列或已知来源的基因组；二、单标签的核酸序列与人类基因组序列无匹配；三、单标签来源为生物，如果是微生物，为非常见病原菌。
[0009]优选，所述n为人为标准化设定，取值为不低于10的整数。
[0010]优选，所述n为10000。
[0011]优选，所述步骤2中，每次使用时取出1管单标签添加至同批次的临床样本中，不可反复冻融。
[0012]本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术可实现mNGS测序数据的均一化，在去除人源宿主测序信息影响的前提下比较不同样本间的病原菌实际检出情况；目前mNGS领域未有针对测序数据中人源比例相对定量的方法报道，本专利技术大大提升mNGS测序数据的真实性和准确性；（2）本专利技术操作简便，无需增加较多操作步骤和试剂耗材；本专利技术仅在样本中增加可定制化的同一来源的单标签，并随mNGS文库构建过程流转，直至流转至上机测序环节，通过对测序数据的分析校正，即可完成对宿主测序数据的均一化。
具体实施方式
[0013]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；
显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0014]本专利技术的采用单标签进行相对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用单标签进行相对定量的mNGS病原检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：制备单标签：单标签采用人工合成或购买已选择的菌株，菌株浓度为100 μg/mL，按预估使用量分装至不同的1.5 mL EP管中，保存在
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80℃冰箱；步骤2：mNGS样本中单标签的添加：临床样本收录后，样本按照单次提取用量分装至2.0 mL EP管中，取出分装好的单标签，室温化冻，彻底融化后置于涡旋震荡仪上震荡混匀，8000 rpm/min转速下离心30 sec，每个样本中添加10μl离心好的单标签，混匀后进行核酸提取和mNGS文库构建；步骤3：测序数据均一化标准化：设定1μg单标签在无人源宿主影响条件下理论检出reads数为n；均一化指数=n/临床样本中单标签实际检出reads数；均一化后某病原菌检出数=均一化指数
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下机数据中某病原...

【专利技术属性】
技术研发人员：康亮亮，曹德盼，姚佳玥，杨俊，李东东，纪丹丹，蒋智，
申请(专利权)人：天津金匙医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：