一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产L-苏氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产L

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产L
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苏氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种利用过表达nMagHigh基因的重组大肠杆菌和过表达pMagHigh基因的重组大肠杆菌共培养发酵产L
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苏氨酸的方法。

技术介绍

[0002]苏氨酸(L
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threonine)是人体所必需的八种氨基酸中的之一。苏氨酸在人体内和动物体内不能合成，但是在生命过程中发挥重要的作用。现如今，L
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苏氨酸已经成为了继甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸以外第四种重要的氨基酸。在食品产业、医疗制药行业和化妆品行业中L
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苏氨酸已被广泛应用，需求量逐年增加。在食品行业中，L
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苏氨酸作为一种食品添加剂，主要用作食品强化剂，提高食品中的营养成分，补充被破坏的营养元素，同时，L
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苏氨酸用于人们常食用的糕点、乳化食品和牛奶之中，发挥抗氧化作用，并且L
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苏氨酸与葡萄糖可以发生反应产生巧克力香味和焦香味道，可以用作食品的增香剂。L
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苏氨酸在医疗行业领域中可以存进T淋巴细胞成熟发育，也可以提高人体免疫功能。L
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苏氨酸除了是重要的食品强化剂外，也是一种重要的饲料添加剂，主要添加到家禽和猪饲料之中。
[0003]光对大肠杆菌生物膜的形成是有影响的。环二鸟苷酸(c
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di
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GMP)是细菌中形成的第二信使，参与大肠杆菌运动性、生物膜形成、毒力、细胞周期等有关。c
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di
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GMP由双鸟苷酸环化酶合成，并被磷酸二酯酶降解，这两种酶分别含有GGDEF(Gly
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Gly
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Asp
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Glu
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Phe)和EAL(Glu
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Ala
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Leu)结构域。除了LOV蛋白是蓝光感受器外，还包括光活性黄色蛋白(PYP)和FAD(BLUF)结构域蛋白的蓝光感应器。其中BLUF
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EAL蛋白BluF(YcgF)是大肠杆菌的感知蓝光蛋白，在蓝光的作用下，通过双组分信号通路，不仅控制调节大肠杆菌中c
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di
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GMP浓度，进而控制生物膜调节器CsgD，调节卷曲菌毛的合成，还通过Ymg/Rcs途径控制糖类表面成分colanic acid，调控生物膜的形成和功能。因此，BLUF蛋白在大肠杆菌中，通过蓝光调节转录因子活性，控制大肠杆菌生物膜的形成。
[0004]生物膜的扩散是可以通过遗传学以及合成生物学等工具等进行操作。光遗传学通常利用光控制基因的表达、调控蛋白质与蛋白质之间的相互作用、启动系统等。光遗传学工具和传统化学方法相比，操作简单便捷，实现了高时空控制，具有可编程性，可调性等。目前，各种光遗传学工具在不同模式生物中的应用已经成为一大研究热点。其中光遗传学元件Magnet系统的应用引起了研究人员的关注，它是由两种不同的活性蛋白变体组成，一种带正电，一种带负电，分别指定为正磁铁(pMag)和负磁铁(nMag)，这两种蛋白质通过静电作用相互结合，提供了具有选择性和可逆性的光诱导异二聚化，并通过磁铁系统操纵细胞功能，例如蛋白质
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蛋白质的相互作用与基因组编辑。因此，本专利技术提供了一种利用过表达nMagHigh与pMagHigh基因的重组大肠杆菌的构建方法及应用。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供三株不同的重组大肠杆菌。
[0006]微生物的发酵过程与生物膜的形成密切相关。近年来，有研究人员发现，光对大多数微生物的生活方式存在影响，光遗传学工具的有效使用也成为微生物研究中的一大热点。然而，蓝光对大肠杆菌生物膜的形成存在抑制作用，进而减少大肠杆菌的发酵产量。L
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苏氨酸发酵已在单批次游离发酵中进行，发酵后不能重复使用的模式。批量发酵和一次性使用细胞会增加操作成本并降低生产率。同时，分散在发酵培养基中的游离细胞在有氧发酵过程中受到应力条件(例如剪切力)的挑战，导致在发酵过程中细胞活力降低。基于生物膜的固定发酵具有更高的代谢活性以及细胞重复利用以达到节约成本。因此，本专利技术还要解决的技术问题是提供一种发酵产L
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苏氨酸的方法。
[0007]为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一株重组大肠杆菌，即在出发菌中敲除bluF基因，即为重组大肠杆菌
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bluF。
[0008]本专利技术还公开了第二种重组大肠杆菌，即在出发菌中敲除bluF基因，过表达nMagHigh基因，即为重组大肠杆菌
△
bluF+nMagHigh。
[0009]本专利技术还公开了第三种重组大肠杆菌，即在出发菌中敲除bluF基因，过表达pMagHigh基因，即为重组大肠杆菌
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bluF+pMagHigh。
[0010]其中，所述出发菌均为大肠杆菌。
[0011]其中，所述bluF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]其中，所述nMagHigh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013]其中，所述pMagHigh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0014]为了解决上述第二个技术问题，本专利技术公开了一种发酵产L
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苏氨酸的方法，L
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苏氨酸是人体最重要的氨基酸之一，它的需求是由于其在食品，化学和制药行业的广泛应用而急剧增加。目前，微生物发酵已广泛用于工业以大肠杆菌为最佳候选菌株生产L
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苏氨酸。
[0015]其中，所述方法为利用上述重组大肠杆菌
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bluF+nMagHigh和上述重组大肠杆菌
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bluF+pMagHigh共培养发酵产L
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苏氨酸。
[0016]其中，所述重组大肠杆菌
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bluF+nMagHigh和所述重组大肠杆菌
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bluF+pMagHigh分别按照2％～8％的体积比接入到发酵培养基中。
[0017]其中，所述发酵为固定化发酵，所述固定化发酵过程中，载体的用量优选为10～50g/L发酵培养基，进一步优选为30g/L发酵培养基。
[0018]其中，所述发酵的温度为30～44℃。
[0019]其中，所述发酵为在波长为450～480nm、光照度为400～600lux的蓝光下进行发酵。
[0020]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：
[0021](1)本专利技术构建了一株敲除bluF基因的重组大肠杆菌，实验结果表明，bluF基因的敲除解除了蓝光对大肠杆菌生物膜形成的抑制，同时对菌株的生长能力、发酵能力没有产生影响，并将蓝光影响生物膜形成相关基因进行验证。同本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌中敲除bluF基因，即为重组大肠杆菌
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bluF。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌中敲除bluF基因，过表达nMagHigh基因，即为重组大肠杆菌
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bluF+nMagHigh。3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌中敲除bluF基因，过表达pMagHigh基因，即为重组大肠杆菌
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bluF+pMagHigh。4.根据权利要求1～3中任意一项所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述bluF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。5.根据权利要求2所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述nMagHigh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。6.根据权利要求3所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述pMagHigh...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，石书琪，陈勇，孙文俊，李国雄，赵伟，陈天鹏，余斌，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：