酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建及应用方法，通过多水平代谢工程策略首次实现了酿酒酵母以葡萄糖为碳源从头合成绿原酸，主要通过以下手段实现：比较关键酶奎尼酸脱氢酶YdiB活性，引入最佳来源的绿原酸合成途径；移除莽草酸合成路径中的限速因子来强化绿原酸合成的代谢流；通过平衡赤藓糖四磷酸E4P和磷酸烯醇式丙酮酸PEP之间的配比来增强前体供应；增加绿原酸合成途径中羟基肉桂酰

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及到一种酿酒酵母产绿原酸工程菌株的 构建及应用。

技术介绍

[0002]绿原酸(Chlorogenic acid)是最重要的膳食酚酸化合物之一，常见于绿 色咖啡豆、金银花、杜仲叶等植物中，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、清除自 由基等药理作用，在食品和医药领域应用广泛。
[0003]目前市场的绿原酸(CGA)主要是从植物中提取的，但是，复杂的分离过程 以及植物中低含量的绿原酸和相关植物的生长速度严重阻碍了从植物中高效提 取绿原酸，被认为是能源密集型和对环境不友好且昂贵的生产方式。为了满足 不断增长的市场需求，利用合成生物学和代谢工程技术构建异源生物合成的微 生物代谢工程菌株可提供另一种可持续的生产方法。目前，使用大肠杆菌作为 底盘细胞构建的生产绿原酸微生物菌株，需要添加大量的前体咖啡酸，成本 高。而且，以葡萄糖为底物从头合成绿原酸的微生物菌株尚无报道。酿酒酵母 是食品安全菌株，与大肠杆菌等原核细胞相比，酿酒酵母具有在简单培养基中 容易生长，产物易分离纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建方法，包括如下步骤：1)选取菌株和质粒：大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建和繁殖；以酿酒酵母CEN.PK2
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1C作为出发菌株；2)DNA操作：所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母CEN.PK2
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1C基因组DNA或可用质粒作为模板进行PCR扩增；对于密码子优化的异源基因，使用合成片段或可用质粒进行PCR扩增；来自拟南芥的At4CL1通过使用拟南芥cDNA作为模板进行扩增；密码子优化的三个基因AtPAL2、AtC4H和AtATR2均来自拟南芥，从质粒pCfB2584和pCfB2767获得；两个表达盒包括来自酿酒酵母的CYB5和密码子优化的来自拟南芥的At4CL2分别从pCfB2767和pCfB2584直接扩增；密码子优化的HaTAL和AtC3'H及其P450还原酶基因AtATR1均来自拟南芥，从质粒pTAL和pLC
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c3提供；EcYdiB和EcaroL扩增来自大肠杆菌基因组DNA，并分别从相应的克隆载体pHQT2、pQDH2和pQa3扩增了密码子优化的三个基因CsHQT2、PtQDH2和NcQa3；然后，将这些候选基因、启动子或终止子克隆到辅助质粒pH1、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6或pUC19使用限制性连接或Gibson组装获得基因表达盒质粒；3)菌株构建：采用CRISPR/Cas9系统，使用Cas9和gRNA表达质粒在酿酒酵母菌株中进行基因缺失和DNA片段位点特异性整合；为了促进基因操作，从p42H
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spCas9扩增了Cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母CEN.PK2
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1C中的IX
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1基因组位点，由此产生的菌株YT00：CEN.PK2
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1C、IX1::TEFp
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SpCas9
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ADH2t被用作DNA整合和生物合成途径工程的宿主；然后使用LiAc/ssDNA/PEG酵母转化法将等摩尔量的纯化线性化片段与相应的gRNA质粒共转化到S.cerevisiae，并在补充有200μg/L G418的YPD平板上选择转化子；使用Green Taq Mix通过菌落PCR验证克隆；随后，这些具有正确模块整合的克隆在YPD液体培养基中培养过夜，然后在不含抗生素的平板上划线以环出gRNA载体。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：还包括步骤4)，包括下列子步骤：4.1)基于苯丙氨酸途径利用葡萄糖从头合成对香豆酸途径的构建：在YT00菌株基础上通过引入苯丙氨酸裂解酶AtPAL2、肉桂酸羟化酶AtC4H构建了酿酒酵母中从苯丙氨酸到香豆酸CIA的路径，标记菌株YT01；后继分别引入P450还原酶AtATR2，并过表达酵母天然细胞色素CYB5，构建CIA到对香豆酸p
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HCA的生物合成途径，获得菌株YT02；4.2)葡萄糖从头合成绿原酸途径的构建：在YT02菌株基础上通过整合奎宁酸脱氢酶EcYdiB、羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶CsHQT2、对香豆酸3'
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羟化酶AtC3'H连同细胞色素P450还原酶AtATR2和4
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香豆酸
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CoA连接酶1At4CL1，获得菌株YC01；4.3)通过释放莽草酸途径中的碳通量提高绿原酸产量：在YC01菌株基础上选择过表达ARO4
K229L
突变体，最大限度地增加进入SA途径的碳通量，提高CGA产量；得到菌株YC02，YC01,
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trp1::TEF1p
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ARO4
K229L
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CYC1t，CGA产量达51.7mg/L，比YC01提高了40％；4.4)优...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，涂帅，肖锋，黄子炎，谢琳琳，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：