一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体、其构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体、其构建方法及应用，属于医学基因工程技术领域。本发明专利技术是在人类5型腺病毒基因的E1A保守序列2区缺失第920nt

【技术实现步骤摘要】
一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体、其构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体、其构建方法及应用，属于医学基因工程


技术介绍

[0002]基因治疗(gene therapy)是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。作为基因治疗载体，溶瘤病毒治疗恶性肿瘤的发展前景良好。在众多溶瘤病毒疗法的载体中，重组腺病毒载体是应用最为广泛的，其临床可行性和安全性已获公认。腺病毒基因治疗载体具有以下生物学优势和临床应用优势：(1)感染谱广，对多种组织源性的细胞，无论是处于分裂期还是静止期的细胞，均能有效攻击，抗癌谱广；(2)腺病毒进入细胞后，不整合到宿主染色体，无突变和致癌的危险性，临床应用安全，使用后仅产生类似感冒样症状，无造血功能和免疫功能抑制；(3)临床应用方便，有腔隙(如腹腔、胸腔和颅腔)给药、局部或瘤体内直接注射(一点或多点)以及介入治疗等途径；(4)腺病毒在体内持续表达仅两到三周，尤其适合肿瘤治疗；(5)经静脉或局部应用仅产生轻微的炎症反应，副作用轻微；(6)临床级数量的腺病毒易于生产和纯化。基于以上的优势，越来越多的腺病毒载体被构建产生，并显示出良好的临床应用前景。
[0003]虽然腺病毒相较于其它各种基因治疗载体表现出明显的优势，国内外现有的腺病毒治疗载体也逐步取得了一些突破性的进展，但仍然有一些不可规避的缺点限制其广泛应用，具体如下：(1)肝脏趋向性。腺病毒进入生物体后，无论是静脉系统性注射，或是瘤内注射，胸腔、腹腔等局部注射，生物体内凝血因子十(Fx)会迅速识别腺病毒衣壳蛋白Hexon，与其结合，并将腺病毒带至肝脏，凝血因子的另一侧则与肝细胞表面的硫酸类肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycans,简称HSPGS)结合，即凝血因子在腺病毒与肝细胞间形成桥梁，被肝脏捕获的腺病毒则逐渐被kupffer细胞或者肝脏中的巨噬细胞吞噬。而未被清除的腺病毒在肝脏中大量复制，导致肝脏急性损伤，表现为转氨酶迅速升高。(2)腺病毒感染肿瘤细胞，依赖于肿瘤细胞表面柯萨奇腺病毒受体(CAR)。而在大多数肿瘤细胞中，受体处于低表达状态，不利于腺病毒进入肿瘤细胞内发挥杀伤作用。
[0004]综上，目前肿瘤治疗技术和实践中均存在各种弊端，因此，有必要提供一种新的靶向与强效杀伤兼具的治疗应用途径，以解决现有技术的不足。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一，是提供一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体。
[0006]本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体，该携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体为Ad5/Δ27/TMVP1/ΔADP
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tBid，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，是在人类5型腺病毒基因的E1A保守序列2区缺失第920nt
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946nt区域如SEQ ID NO.1所示的27个碱基，再在Hexon高变区5的第19641nt
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19655nt区域插入如
SEQ ID NO.15所示的编码肿瘤靶向肽TMVP1的基因序列，同时缺失E3区位于ADP基因第29477nt
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29714nt区域，构成缺失区，再在所述缺失区插入如SEQ ID NO.22所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入Cla1酶切位点。
[0007]本申请的专利技术人，为了获得上述携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体，进行了如下工作：
[0008]人类5型腺病毒，英文名称为Human adenovirus type 5，简称Ad5。
[0009]在人类5型腺病毒基因的E1A保守序列2区(CR2)缺失第920nt
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946nt如SEQ ID NO.1所示的27个碱基，在灭活E1a蛋白的Rb结合特性的同时，达到尽可能保留E1a转录激活特性的效果。
[0010]肿瘤靶向肽TMVP1具有靶向高转移潜能肿瘤细胞、早期识别肿瘤亚临床微小转移灶、可选择性被肿瘤细胞内吞并和较强的肿瘤细胞毒效应等明显优势。本专利技术通过在人类5型腺病毒中插入如SEQ ID NO.15所示的编码肿瘤靶向肽TMVP1的基因序列，从而显著提高了携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体的靶向性。
[0011]凋亡是各种抗癌药物杀伤肿瘤细胞的最主要环节，由BCL
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2(B
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cell lymphoma
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2)家族调控。而Bid是BCL
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2家族中促进细胞凋亡的线粒体凋亡肽，当细胞感知到损伤后，caspase8被激活，激活后的caspase8则可将游离于细胞质中的Bid剪切为tBid，tBid重新在线粒体外膜上聚集，激活下游bak/bax，使其通过寡聚化形成二聚体和三聚体，从而在线粒体上打孔，引起线粒体外膜去极化(MOMP)，最终导致细胞凋亡。本专利技术通过在人类5型腺病毒(Ad5)插入如SEQ ID NO.22所示的编码线粒体凋亡肽活性形式tBid的基因序列，使线粒体凋亡肽tBid在肿瘤中特异性表达，促进肿瘤细胞凋亡，从而显著提高了携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体促凋亡作用和溶瘤病毒溶解细胞的杀伤效应。
[0012]进一步的，本专利技术实施例的编码肿瘤靶向肽TMVP1的基因序列插入于人类5型腺病毒基因的Hexon高变区2、5和7区域，通过体外实验筛选出能够在肿瘤细胞中高拷贝数复制的最佳腺病毒插入区为高变区5。在Hexon高变区5插入编码肿瘤靶向肽TMVP1基因序列，从而破坏Hexon蛋白的正常表达，抑制Fx与Hexon的结合而阻止腺病毒被肝脏吞噬。插入肿瘤靶向肽TMVP1能降低腺病毒对肿瘤细胞表面柯萨奇腺病毒受体(CAR)的依赖性，增加腺病毒对肿瘤细胞的亲和性；破坏Hexon高变区完整性，减少腺病毒在肝脏中聚集，降低腺病毒对肝脏损害。
[0013]综上，本专利技术的携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体能特异性识别肿瘤及其转移灶，具有更高的肿瘤靶向复制能力，利用tBid的促凋亡作用和溶瘤病毒溶解细胞的双重杀伤效应，体内外实验验证其对顺铂耐药的细胞系有强效杀伤效应，兼具理想的靶向作用和强效杀伤作用。
[0014]本专利技术的携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体的有益效果是：
[0015]1、本专利技术的携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体具有肿瘤选择性复制及治疗基因表达的强选择性；
[0016]2、肿瘤细胞内子代溶瘤腺病毒产量高，细胞裂解后在肿瘤局部可产生高浓度的病毒治疗圈，加之与治疗靶点的优势联合，可形成强效的旁观者效应；
[0017]3、肿瘤细胞内溶瘤腺病毒高效、大量扩增，同时转录出大量治疗靶基因，让肿瘤细胞成为治疗蛋白合成的“加工厂”；
[0018]4、携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体的免疫调节蛋白功能完整，一定程度上避免了机体对重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体，其特征在于，该携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体为Ad5/Δ27/TMVP1/ΔADP
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tBid，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，是在人类5型腺病毒基因的E1A保守序列2区缺失第920nt
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946nt区域如SEQ ID NO.1所示的27个碱基，再在Hexon高变区5的第19641nt
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19655nt区域插入如SEQ ID NO.15所示的编码肿瘤靶向肽TMVP1的基因序列，同时缺失E3区位于ADP基因第29477nt
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29714nt区域，构成缺失区，再在所述缺失区插入如SEQ ID NO.22所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入Cla1酶切位点。2.权利要求1所述的携带TMVP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：人类5型腺病毒基因的定向缺失利用基因合成和同源重组的方式定向缺失人类5型腺病毒基因的E1A保守序列2区第920nt
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946nt如SEQ ID NO.1所示的27个碱基，获得定向缺失后的人类5型腺病毒基因Ad5/Δ27；步骤2：制备Ad5/Δ27/TMVP1在步骤1获得的定...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，陈世民，杨帆，高庆蕾，纪腾，
申请(专利权)人：武汉凯德维斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：