用于邻近连接的方法和组合物技术

本文提供了邻近连接的方法和用于这样的方法的组合物。本文还提供了与单个细胞核酸构象评估或单个细胞核酸序列或相位信息确定相关的实施方案。可以将构象保留或构象重建的核酸样品片段化并分成等分试样，向其中添加等分试样区分序列片段，以便在分析从样品产生的配对末端文库时，将配对末端分配给来源的分区或细胞。因此可以确定序列和三维核酸构象的细胞特异性变异。特异性变异。特异性变异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于邻近连接的方法和组合物
交叉引用
[0001]本申请要求于2019年6月27日提交的美国临时专利申请号62/867,463、于2019年11月5日提交的美国临时专利申请号62/931,069、于2020年4月17日提交的美国临时专利申请号63/011,490、于2019年7月3日提交的美国临时专利申请号62/870,297和于2020年4月23日提交的美国临时专利申请号63/014,422的权益，其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。

技术介绍

[0002]特别是当可用于序列分析的源材料有限的情况下，获得高质量、连续的基因组序列通常很困难。虽然获取原始序列数据变得更快且成本更低，但用于有效且准确地分析和组装数据的合适方法仍然是一个挑战。

技术实现思路

[0003]在一方面，提供了核酸分析的方法。在一些情况下，方法可以包括：(a)获得包含与至少一个核酸结合蛋白复合的核酸分子的稳定化生物样品；(b)将所述稳定化生物样品与非特异性核酸内切酶接触以将所述核酸分子切割成多个片段；(c)将所述多个片段中的第一片段和第二片段在连接序列处附接；以及(d)对所述多个片段进行大小选择以获得多个选择片段。在一些情况下，所述多个选择片段为约145bp至约600bp。在一些情况下，所述多个选择片段为约100bp至约2500bp。在一些情况下，所述多个选择片段为约100bp至约600bp。在一些情况下，所述多个选择片段为约600bp至约2500bp。在一些情况下，所述方法进一步包括，在步骤(d)之前，从所述多个片段制备测序文库。在一些情况下，所述方法进一步包括对所述测序文库进行大小选择以获得大小选择的文库。在一些情况下，所述大小选择的文库的大小为约350bp至约1000bp。在一些情况下，使用凝胶电泳、毛细管电泳、大小选择珠或凝胶过滤柱进行所述大小选择。在一些情况下，所述方法进一步包括分析所述多个选择片段以获得QC值。在一些情况下，所述QC值是基于步骤(d)之前100bp至2500bp大小的片段比例的染色质消化效率(CDE)。在一些情况下，所述方法进一步包括当所述CDE值为至少65％时，选择样品以进行进一步分析。在一些情况下，所述QC值是基于步骤(d)之前单核小体大小的片段数量与双核小体大小的片段数量之比的染色质消化指数(CDI)。在一些情况下，所述方法进一步包括当所述CDI值大于
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1.5且小于1时，选择样品以进行进一步分析。在一些情况下，所述方法进一步包括在所述将所述稳定化生物样品与非特异性核酸内切酶接触之后，将所述多个片段结合至一个或更多个表面。在一些情况下，所述一个或更多个表面包括一个或更多个珠。在一些情况下，所述一个或更多个珠是固相可逆固定(SPRI)珠。在一些情况下，所述稳定化生物样品包括稳定化细胞裂解物。在一些情况下，所述稳定化生物样品包括稳定化完整细胞。在一些情况下，所述稳定化生物样品包括稳定化完整细胞核。在一些情况下，步骤(b)在所述完整细胞或所述完整细胞核的裂解之前进行。在一些情况下，所述方法进一步包括在步骤(c)之前，裂解所述稳定化生物样品中的细胞和/或细胞核。在
一些情况下，所述稳定化生物样品包含少于3,000,000个细胞。在一些情况下，所述稳定化生物样品包含少于1,000,000个细胞。在一些情况下，所述稳定化生物样品包含少于100,000个细胞。在一些情况下，所述稳定化生物样品包含小于10μg的DNA。在一些情况下，所述稳定化生物样品包含小于1μg的DNA。在一些情况下，所述非特异性核酸内切酶是DNase。在一些情况下，所述DNase是DNase I。在一些情况下，所述DNase是DNase II。在一些情况下，所述DNase是微球菌核酸酶。在一些情况下，所述DNase选自DNase I、DNase II和微球菌核酸酶中的一种或更多种。在一些情况下，所述稳定化生物样品已用交联剂处理。在一些情况下，所述交联剂是化学固定剂。在一些情况下，所述化学固定剂包括甲醛。在一些情况下，所述化学固定剂包括补骨脂素。在一些情况下，化学固定剂包括双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)。在一些情况下，所述化学固定剂包括乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)。在一些情况下，所述化学固定剂包括双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)和乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)。在一些情况下，所述交联剂是紫外光。在一些情况下，所述稳定化生物样品是交联的石蜡包埋的组织样品。在一些情况下，所述方法进一步包括将所述多个选择片段与抗体接触。在一些情况下，所述方法进一步包括对所述多个片段进行免疫沉淀。在一些情况下，在所述附接之后进行所述免疫沉淀。在一些情况下，附接包括使用生物素标签化的核苷酸填充粘性末端。在一些情况下，附接包括使用未标签化的核苷酸填充粘性末端。在一些情况下，附接包括连接钝性末端。在一些情况下，附接包括添加突出端。在一些情况下，添加突出端包括腺苷酸化。在一些情况下，附接包括将至少所述第一片段和所述第二片段与至少一个桥接寡核苷酸接触。在一些情况下，所述桥接寡核苷酸的长度为至少10bp。在一些情况下，所述桥接寡核苷酸的长度为至少12bp。在一些情况下，所述桥接寡核苷酸的长度为12bp。在一些情况下，所述桥接寡核苷酸包含条形码序列。在一些情况下，所述桥接寡核苷酸包含亲和标签。在一些情况下，所述亲和标签是生物素。在一些情况下，附接包括将至少所述第一片段和所述第二片段与多个桥接寡核苷酸串联接触。在一些情况下，附接导致所述稳定化生物样品的样品、细胞、细胞核、染色体或核酸分子接收独特的桥接寡核苷酸序列。在一些情况下，所述至少一个桥接寡核苷酸与免疫球蛋白结合蛋白或其片段偶联。在一些情况下，所述至少一个桥接寡核苷酸与两个或更多个免疫球蛋白结合蛋白或其片段偶联或融合。在一些情况下，所述免疫球蛋白结合蛋白选自蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G和蛋白质L。在一些情况下，附接包括将至少所述第一片段和所述第二片段与条形码接触。在一些情况下，所述方法不包括剪切步骤。在一些情况下，所述方法进一步包括：(e)在所述连接序列的每一侧获得至少一些序列以生成第一读取对。在一些情况下，所述方法进一步包括(f)将所述第一读取对映射到重叠群的集合上；以及(g)确定通过所述重叠群的集合的代表到基因组的顺序和/或取向的路径。替代地或组合地，所述方法进一步包括(f)将所述第一读取对映射到重叠群的集合上；以及(g)从所述重叠群的集合确定所述稳定化生物样品中的结构变体的存在或杂合性丢失。替代地或组合地，所述方法进一步包括(f)将所述第一读取对映射到重叠群的集合上；以及(g)将所述重叠群的集合中的变体分配给相位。在一些情况下，所述变体是人类白细胞抗原(HLA)变体。在一些情况下，所述变体是杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)变体。替代地或组合地，所述方法进一步包括(f)将所述第一读取对映射到重叠群的集合上；(g)从所述重叠群的集合确定所述重叠群的集合中的变体的存在；以及(h)进行选自以下一项或多项的步骤：(1)鉴定所述稳定化生物样品的疾病分期、预后或治
疗过程；(2)基于所述变体的所述存在选择药物；或(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，包括：(a)获得包含与至少一个核酸结合蛋白复合的核酸分子的稳定化生物样品；(b)将所述稳定化生物样品与非特异性核酸内切酶接触以将所述核酸分子切割成多个片段；(c)将所述多个片段中的第一片段和第二片段在连接序列处附接；以及(d)对所述多个片段进行大小选择以获得多个选择片段。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个选择片段为约145bp至约600bp。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个选择片段为约100bp至约2500bp。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个选择片段为约100bp至约600bp。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个选择片段为约600bp至约2500bp。6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括，在步骤(d)之前，从所述多个片段制备测序文库。7.根据权利要求6所述的方法，进一步包括对所述测序文库进行大小选择以获得大小选择的文库。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述大小选择的文库的大小为约350bp至约1000bp。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中使用凝胶电泳、毛细管电泳、大小选择珠或凝胶过滤柱进行所述大小选择。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析所述多个选择片段以获得QC值。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述QC值是基于步骤(d)之前100bp至2500bp大小的片段比例的染色质消化效率(CDE)。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法进一步包括当所述CDE值为至少65％时，选择样品以进行进一步分析。13.根据权利要求10所述的方法，其中所述QC值是基于步骤(d)之前单核小体大小的片段数量与双核小体大小的片段数量之比的染色质消化指数(CDI)。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法进一步包括当所述CDI值大于
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1.5且小于1时，选择样品以进行进一步分析。15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括，在所述将所述稳定化生物样品与非特异性核酸内切酶接触之后，将所述多个片段结合至一个或更多个表面。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或更多个表面包括一个或更多个珠。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一个或更多个珠是固相可逆固定(SPRI)珠。18.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包括稳定化细胞裂解物。19.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包括稳定化完整细胞。20.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包括稳定化完整细胞核。21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中步骤(b)在所述完整细胞或所述完
整细胞核的裂解之前进行。22.根据权利要求1所述的方法，进一步包括，在步骤(c)之前，裂解所述稳定化生物样品中的细胞和/或细胞核。23.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包含少于3,000,000个细胞。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包含少于1,000,000个细胞。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包含少于100,000个细胞。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包含小于10μg的DNA。27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品包含小于1μg的DNA。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述非特异性核酸内切酶是DNase。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNase是DNase I。30.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNase是DNaseII。31.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNase是微球菌核酸酶。32.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNase选自DNase I、DNaseII和微球菌核酸酶中的一种或更多种。33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述稳定化生物样品已用交联剂处理。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述交联剂是化学固定剂。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学固定剂包括甲醛。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学固定剂包括补骨脂素。37.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学固定剂包括双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)。38.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学固定...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊丽莎白，
申请(专利权)人：多弗泰尔基因组学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：