猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，所述的单克隆抗体3的的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示；所述的单克隆抗体8的的重链可变区序列如SEQ ID NO.4所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.5所示；所述的单克隆抗体3结合的抗原表位位于优化后的PRRSV GP5蛋白的aa34

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于病毒疫病诊断
，具体涉及猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪繁殖和呼吸障碍综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，简称PRRS)，俗称蓝耳病(Blue Ear Disease)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的传染病。PRRS可导致母猪出现繁殖障碍及仔猪出现严重呼吸道疾病，是一种严重影响经济效益的猪传染病。
[0003]PRRSV为单股正链RNA(大小约15kb)，不分节段病毒，该病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。PRRSV是一种有囊膜的病毒，似球状，直径45～65nm，囊膜表面有纤突，相对平滑。PRRSV可在猪肺泡巨噬细胞上生长(PAM细胞)，在MARC
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145细胞上培养可出现细胞圆缩、聚集和崩解等明显的细胞病变(CPE)。PRRSV的RNA其5
‘
端具有帽子结构(5
‘‑
Cap)，3
’
端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构(3
’‑
polyA)，共含有9个开放阅读框(ORF)，分别为1a、1b、2a、2b、3、4、5、6、7。相邻ORF间有重叠区域。PRRSV的主要结构蛋白包括GP5蛋白(囊膜糖蛋白)、M蛋白(基质蛋白)、N蛋白(核衣壳蛋白)，次要结构蛋白则有GP2、GP3、GP4等。
>[0004]GP5蛋白由ORF5编码，约26～30kD，是一个糖基化蛋白，含有4个糖基化位点，有6个抗原决定簇。有证据表明GP5在PRRSV的抗体识别过程中起关键作用，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，是公认的PRRSV的主要保护性抗原，也是PRRSV诊断的靶标抗原之一。

技术实现思路

[0005]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一，提供一种PRRSV GP5蛋白的单克隆抗体及其制备方法；本专利技术的目的之二，提供了一种使用本专利技术制备的GP5蛋白和单克隆抗体制备猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒。
[0006]因此，本专利技术一方面公开了一种一种猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，所述的单克隆抗体均能特异性结合PRRSV GP5蛋白；所述的单克隆抗体3的的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，所述的单克隆抗体3的轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示；所述的单克隆抗体8的的重链可变区序列如SEQ ID NO.4所示，所述的单克隆抗体8的轻链可变区序列如SEQ ID NO.5所示。
[0007]优选地，本专利技术所述的单克隆抗体3结合的抗原表位位于优化后的PRRSV GP5蛋白的aa34
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aa48位，所述的优化后的PRRSV GP5蛋白的aa34
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aa48位氨基酸序列为ETFVIFPVLTHIVSY。
[0008]优选地，本专利技术所述的单克隆抗体8的抗原表位位于优化后的PRRSV GP5蛋白的aa96
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aa109位，所述的优化后的PRRSV GP5蛋白的aa96
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aa109位氨基酸序列为LAKNCMSWRYSCTR。
[0009]另一方面，本专利技术还公开了一种制备所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：1)PRRSV GP5蛋白的制备；2)特异性表达抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备；3)使用步骤2)制备的杂交瘤细胞制备小鼠腹水，从腹水中纯化抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体。
[0010]优选地，本专利技术所述的步骤1)中制备PRRSV GP5蛋白时，表达GP5蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]再一方面，本专利技术还公开了一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的权利要求1所述的单克隆抗体3和单克隆抗体8；以及配套的检测试剂。
[0012]优选地，本专利技术所述试剂盒为胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括包含有单克隆抗体3和单克隆抗体8的试纸条以及样品稀释液。
[0013]优选地，本专利技术所述试剂盒中试纸条包括样品垫、乳胶微球垫、检测线、质控线、吸收垫。
[0014]优选地，本专利技术所述试剂盒中试纸条中的乳剂微球垫包含有单克隆抗体3，所述的检测线包含有单克隆抗体8。
[0015]本专利技术制备的PRRSV GP5蛋白适用于制备不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断试剂，如胶体金、化学发光检测试剂盒等。本专利技术制备的抗PRRSV GP5蛋白的单克隆抗体3和单克隆抗体8具有良好的特异性和敏感性，适用于制备不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断试剂，如胶体金、ELISA、化学发光等检测试剂盒。
[0016]本专利技术所提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒(胶体金检测试纸条)适用于猪血清、组织、全血和抗凝血中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快(10min内完成)，可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的早期筛查，特别适合现场猪繁殖与呼吸综合征感染诊断、流行病学调查等。
附图说明
[0017]图1 PRRSV GP5蛋白纯化后SDS
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PAGE图，1是纯化后的PRRSV GP5蛋白。
[0018]图2试纸条的组装示意图，其中A：样品垫，B：乳胶微球垫，C：检测线，D：质控线，E：吸收垫。
[0019]图3试纸条检测结果判定模式图。
[0020]图4特异性检验部分结果，1
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7分别为21101批试纸条检测猪口蹄疫O型病毒抗原、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的结果图。
具体实施方式
[0021]以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0022]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0023]实施例1：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的制备
[0024]将GenBank:MH579772.1的PRRSV GP5蛋白去除N端31个氨基酸(信号肽序列)后的
核苷酸序列进行密码子优化，将密码子优化后的PRRSV GP5蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)克隆到原核表达载体中，并进行蛋白表达纯化。具体方法简述如下：以密码子优化的PRRSV GP5蛋白的核苷酸序列为模板，分别用EcoRI、BamHI并在C端加入6个His标签，克隆到载体pET
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30a中。把重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落于含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB培养基中，37℃、225r/min摇床培养至对数生长期(OD600约为0.6)时，加入IPTG转入16℃，过夜诱导表达目的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体均能特异性结合PRRSV GP5蛋白；所述的单克隆抗体3的的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，所述的单克隆抗体3的轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示；所述的单克隆抗体8的的重链可变区序列如SEQ ID NO.4所示，所述的单克隆抗体8的轻链可变区序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体3结合的抗原表位位于优化后的PRRSV GP5蛋白的aa34
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aa48位，所述的优化后的PRRSV GP5蛋白的aa34
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aa48位氨基酸序列为ETFVIFPVLTHIVSY。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体8的抗原表位位于优化后的PRRSV GP5蛋白的aa96
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aa109位，所述的优化后的PRRSV GP5蛋白的aa96
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aa109位氨基酸序列为LAKNCMSWRYSCTR。4.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙统威，徐慧珍，周晶晶，查银河，
申请(专利权)人：杭州恒奥科技有限公司，
类型：发明
国别省市：