CITED2基因突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CITED2基因突变体及其应用，所述突变体的cDNA具有序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的核苷酸序列，通过检测该突变体在受试者中是否存在，可以有效确认患者是否具有室间隔缺损相关疾病；同时可以将其应用于试剂盒中，高效筛选出室间隔缺损患者。高效筛选出室间隔缺损患者。高效筛选出室间隔缺损患者。

【技术实现步骤摘要】
CITED2基因突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其是一种CITED2基因突变体及其应用。

技术介绍

[0002]先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是一种严重威胁患者生活健康的先天性畸形，其发病率在所有先天性出生缺陷中居首位。同时，CHD是最常见的致死性畸形，占比高达14.6％。随着人们对产前诊断重要性的逐渐认识，以及新生儿先天性心脏病筛查的普及，我国CHD的发生率呈逐年上升趋势，CHD已成为社会疾病负担的重要组成部分。室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)是最常见的CHD，约占CHD的20％
‑
30％。
[0003]目前认为大约90％的先心病是遗传因素及环境致畸因素共同作用的结果。随着人们生活水平和预防意识的提高，环境因素在CHD发病过程中的作用将逐渐减弱。同时，先心病遗传学研究揭示了大量与家族性和散发性CHD相关的基因、心脏特异性表达的调节因子、转录因子等在心脏发育中的重要作用。
[0004]CITED2基因是转录辅助因子CITED家族的重要成员之一，位于6号染色体长臂(6q24.1)，含有两个外显子，编码270个氨基酸。CITED2作为一种广泛表达的缺氧
‑
诱导型转录辅因子，与cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREBP)、Ep300同源蛋白具有高亲和力，在心血管胚胎发育中起着重要的调控作用。CITED2与CREBBP/EP300的结合会竞争性抑制EP300和转录因子HIF1A之间的相互作用，从而阻断HIF1A的转录激活，进一步导致心脏畸形。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种CITED2基因突变体。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于提供上述CITED2基因突变体的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
[0008]一种CITED2基因突变体，与野生型CITED2基因的cDNA的SEQ ID NO:1的核苷酸序列相比，具有c.574_579delAGCGGC，p.Ser192_Gly193del的突变(突变体1)。
[0009]上述野生型CITED2基因编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
[0010]上述CITED2基因突变体(突变体1)的cDNA具有序列表SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
[0011]上述CITED2基因突变体(突变体1)编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[0012]一种CITED2基因突变体，与野生型CITED2基因的cDNA的SEQ ID NO:1的核苷酸序列相比，具有c.536_537insGGGCGGCAGCAGCACCCCCGGCGGCTC，p.Ser179_Gly180insGlyArgGlnGlnHisProArgArgLeu的突变(突变体2)。
[0013]上述CITED2基因突变体(突变体2)的cDNA具有序列表SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
[0014]上述CITED2基因突变体(突变体2)编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
[0015]上述CITED2基因突变体在制备先天性心脏病检测试剂盒或检测药剂方面的应用。
[0016]优选的，上述CITED2基因突变体的应用，所述试剂盒包含：
[0017]一对特异性扩增引物：
[0018]正向：5
‑
GCGAGCAAAAGTGGGGTGC
‑3[0019]反向：5
‑
CTTTTAATTCACGCCGAAGAAGTTG
‑3[0020]高保真Taq酶、dNTP mix和PCR buffer。
[0021]有益效果：
[0022]上述CITED2基因突变体，通过检测该突变体在受试者中是否存在，可以有效确认患者是否具有室间隔缺损相关疾病；同时可以将其应用于试剂盒中，高效筛选出室间隔缺损患者。
附图说明
[0023]图1是琼脂糖电泳检测PCR扩增获得的CITED2基因片段。
[0024]图2是两个突变体的测序峰图。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
[0026]实施例1
[0027]在该申请中，专利技术人收集300例散发性VSD患者及300例性别年龄匹配的正常人全血标本；提取全部标本的基因组，根据NCBI数据库中收录的CITED2基因编码区序列，设计上下游引物；优化PCR反应体系和反应程序，扩增获取目的基因片段；PCR产物进行Sanger测序，筛查CITED2基因编码区的突变体。具体实验流程如下：
[0028]1.按照商品化试剂盒操作说明对全部人血样本进行基因组提取，跑琼脂糖电泳验证核酸完整性。
[0029]2.确认最优引物和PCR反应体系/程序
[0030]引物序列：
[0031]正向：5
‑
GCGAGCAAAAGTGGGGTGC
‑3[0032]反向：5
‑
CTTTTAATTCACGCCGAAGAAGTTG
‑3[0033]反应体系：
[0034][0035][0036]PCR程序：
[0037][0038]3.Sanger测序，分析峰图，寻找突变位点
[0039]分别在3例VSD患者中发现突变体1(c.574_579delAGCGGC，p.Ser192_Gly193del)；在1例VSD患者中发现变体2(c.536_537insGGGCGGCAGCAGCACCCCCGGCGGCTC，p.Ser179_Gly180insGlyArgGlnGlnHisProArgArgLeu)。
[0040]这两个突变体在300例正常人全血中均未发现，突变使CITED2蛋白正常氨基酸序列发生改变并影响其生物学功能，可能与VSD发生的密切相关，这个结果提示我们可以通过检测CITED2基因突变来诊断散发性VSD，及其评估VSD患者后代的发病率，为开展室间隔缺损的分子诊断提供了依据。同时该检测方法的用途不受特别限制，例如可用作评估、诊断室间隔缺损，甚至作为治疗或预防该疾病的药物的指示，或者非诊断目的的筛选等。
[0041]实施例2构建CITED2基因突变体1/CITED2基因突变体2表达载体
[0042]利用真核表达载体，以pIRES2为例，按照载体上多克隆位点(MCS)中的限制性内切酶及顺序，设计酶切位点(Sac I/EcoR I)序列，连接至特异性引物:
[0043]正向：5
′‑
CGAGCTCGCGAGCAAAAGTGGGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CITED2基因突变体，其特征在于：与野生型CITED2基因的cDNA的SEQ ID NO:1的核苷酸序列相比，具有c.574_579delAGCGGC，p.Ser192_Gly193del的突变。2.根据权利要求1所述的CITED2基因突变体，其特征在于：cDNA具有序列表SEQ ID NO:3的核苷酸序列。3.一种CITED2基因突变体，其特征在于：与野生型CITED2基因的cDNA的SEQ ID NO:1的核苷酸序列相比，具有c.536_537insGGGCGGCAGCAGCACCCCCGGCGGCTC，p.Ser179_Gly180insGlyArgGlnGlnHisProArgArgLeu...

【专利技术属性】
技术研发人员：何国伟，陈焕新，杨沁，侯海涛，
申请(专利权)人：泰达国际心血管病医院，
类型：发明
国别省市：