一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因及其编码的抗菌肽制造技术

本发明专利技术提供一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因及其编码的抗菌肽，属于基因工程技术领域。所述花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因的cDNA全长序列如SEQ ID NO.6所示，ORF序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。采用固相合成法合成花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因编码的抗菌肽，该抗菌肽对副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均表现出了明显的抑菌作用，可用于制备食品保鲜剂、抗菌饲料添加剂或治疗感染性疾病的药物等应用。药物等应用。

【技术实现步骤摘要】
一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因及其编码的抗菌肽


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因及其编码的抗菌肽。

技术介绍

[0002]海洋鱼类长期暴露在细菌、病毒、真菌等病原体中，在漫长的生物进化过程中形成了专门的防御机制以应对栖息环境所遇到的特定微生物。鱼类是一种低等脊椎动物，特异性免疫功能低下，非特异性免疫在免疫系统中占主要地位，其中，抗菌肽是其非特异性免疫系统的重要组成部分。
[0003]近年来发现的Hepcidin抗菌肽，在鱼类中广泛存在，主要是由生物体肝脏特异性表达的一种阳离子小分子多肽。通过人工合成或重组表达的Hepcidin多肽对于可以抑制多种病毒、细菌、真菌和原生动物的生长繁殖，具有较强的抑菌活性，但到目前为止，还没有关于花尾胡椒鲷Hepcidin抗菌肽的相关研究报道。
[0004]本专利技术以花尾胡椒鲷为研究对象，通过对Hepcidin抗菌肽的基因克隆得到了其序列，并通过固相合成法进行合成，测定其抑菌活性，有望开发成为食品保鲜剂、抗菌饲料添加剂或治疗感染性疾病药物等产品。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因及其编码的抗菌肽。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因，所述花尾胡椒鲷Hepcidin抗菌肽基因的cDNA全长序列如SEQ ID NO.6所示；ORF序列如SEQ ID NO.1所示；。
[0007] 一种花尾胡椒鲷抗菌肽，所述花尾胡椒鲷抗菌肽由权利要求1所述Hepcidin基因的ORF序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，1
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24位氨基酸为信号肽，25
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64位氨基酸为前导肽，65
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90位氨基酸为成熟肽。
[0008]一种含有上述花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因的载体；所述载体包括遗传转化所形成的转基因产物，以及由此产生的外源基因表达产物。
[0009]上述花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因在制备抗菌肽中的应用。
[0010]上述花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因在制备抗菌生物制品中的应用。
[0011]上述花尾胡椒鲷抗菌肽在抑制病原菌中的应用，所述病原菌包括：副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中的任意一种或多种。
[0012]一种包含上述花尾胡椒鲷抗菌肽的药物。
[0013]一种包含上述花尾胡椒鲷抗菌肽的食品保鲜剂。
[0014]一种包含上述花尾胡椒鲷抗菌肽的抗菌饲料添加剂。
[0015]本专利技术的优点在于：（1）利用5
’
RACE、3
’
RACE、基因组测序等技术获得花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因
序列，目前还没有关于花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因的相关研究报道。
[0016]（2）采用固相合成法合成花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因编码的抗菌肽成熟肽蛋白，该抗菌肽对副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌能力，具有制备食品保鲜剂、抗菌饲料添加剂或治疗感染性疾病的药物等多种应用潜力。
附图说明
[0017]图1为总RNA的凝胶电泳图谱。
[0018]图2为中间片段PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
[0019]图3为5
´
RACE产物的凝胶电泳图谱。
[0020]图4为3
´
RACE产物的凝胶电泳图谱。
[0021]图5为ORF全长克隆产物的凝胶电泳图谱。
[0022]图6为阳性克隆PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。1
‑
24为阳性克隆。
[0023]图7为花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因编码的成熟肽蛋白对副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。a为成熟肽蛋白对副溶血性弧菌产生的抑菌圈；b为成熟肽蛋白对大肠杆菌产生的抑菌圈；c：为成熟肽蛋白对金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈；d为成熟肽蛋白对副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈直径。
[0024]图8为花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因编码的成熟肽蛋白对副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。a为成熟肽蛋白对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度；b为成熟肽蛋白对大肠杆菌的最小抑菌浓度；c为成熟肽蛋白对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。
具体实施方式
[0025]以下通过实施例结合附图详细说明本专利技术的技术方案。
[0026]本专利技术所用试剂盒：胶回收试剂盒，Omega Biotek公司；5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Version 2.0)试剂盒，Invitrogen公司；SMARTer
TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒，Clontech公司。
[0027]实施例1 花尾胡椒鲷Hepcidin抗菌肽基因的克隆（1）RNA提取花尾胡椒鲷肝脏放入研钵中，倒入适量液氮后迅速研磨，加入1mL Trizol，室温放置5min，使样本被Trizol充分裂解。每1mL Trizol裂解的样本加入200 μL氯仿，剧烈摇晃15s，于室温放置3min后，在4℃、12000g的条件下离心15min。离心后，转移最上层的无色液体至另一个EP管中，加入500μL 100vol%异丙醇。室温放置10min。在4℃、12000g的条件下离心10min。吸取上清液，加入75vol%乙醇，上下颠倒混匀，在4℃、7500g条件下离心5 min。除去乙醇，开盖室温放置5
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10 min，即得到纯化的RNA。RNA的电泳检测结果如图1所示，从阴极到阳极依次呈现5s、18s和28s三条条带。
[0028]（2）cDNA第一链的合成使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链。在PCR管中加入1μg总RNA、1μL 100μmol/L的oligo (dT)引物，并用DEPC水加至体积
DTT，2.5μL。混合、离心后，42℃温育1min。添加 1 μL SUPERSCRIPT II RT，于42℃温育50min、70℃温育15min，简短离心（3000g）。添加1 μL RNase mix，于37℃反应30min，简短离心（3000g）后置于冰上。
[0035]③
使用DNA Purification System: GLASSMAX DNA isolation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化。
[0036]样本冷却溶液到室温，添加120μL的粘合溶液（6mol/L碘化钠）。转移基因/碘化钠溶液至GLASSMAX旋筒。在1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因，其特征在于：所述花尾胡椒鲷Hepcidin抗菌肽基因的cDNA全长序列如SEQ ID NO.6所示；ORF序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种花尾胡椒鲷抗菌肽，其特征在于：所述花尾胡椒鲷抗菌肽由权利要求1所述Hepcidin基因的ORF序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，1
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24位氨基酸为信号肽，25
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64位氨基酸为前导肽，65
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90位氨基酸为成熟肽。3.一种含有权利要求1所述的花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因的载体。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡嘉淼，王培鑫，张怡，郑宝东，王琳，曹澳彤，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：