一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法。该方法针对末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化进行了大量研究，根据蛋白的性质探究出了最影响该蛋白收率和纯度的关键影响因素，包括蛋白洗脱液、纯化方式、洗脱收集等，所述蛋白洗脱液中含有20～25mM咪唑、10～25mM Trisbase和0.4～0.5M NaCl，pH为7.5～8.0；并进行了系统性的设计和优化，所提出的方案可以显著提升蛋白的得率和纯度，且无核酸残留；而且本发明专利技术纯化策略方便进一步等比放大，能够大规模量产，在生产高纯度、无核酸残留、品质好的末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT蛋白方面具有很好的应用价值。白方面具有很好的应用价值。白方面具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法


[0001]本专利技术涉及酶纯化
，具体地，涉及一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法。

技术介绍

[0002]DNA聚合酶是必不可少的生物催化剂，负责DNA复制和重组以及核酸的修复和维持。这些酶属于根据其序列同源性和系统发育关系建立的六个家族(A、B、C、D、X和Y)之一。构成A家族的聚合酶参与DNA修复和复制，主要成员包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、水生栖热菌DNA聚合酶以及T7 RNA和DNA聚合酶；此外，B和C家族的成员主要参与DNA复制以及D家族聚合酶，但后者仅存在于古细菌中；另一方面，X和Y家族聚合酶分别负责DNA修复和跨损伤DNA合成。TdT(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transfer ase，末端转移酶)是一种X家族聚合酶，它在ssDNA引物的3
’
末端掺入核苷酸，而不依赖于模板的存在。
[0003]TdT与复制型DNA聚合酶的主要不同之处在于它只需要一个单链DNA起始分子来启动合成。在不存在模板的情况下，TdT催化脱氧核糖核苷酸在寡聚或聚脱氧核糖核苷酸引发剂的3
‑
prime
‑
OH末端聚合。基本所有的DNA聚合酶都很依赖二价金属辅助因子的存在来实现催化活性，主要是Mg
2+
。TdT对阳离子没有明显的偏好，Mg
2+
、Zn
2+
、Co
2+
、和Mn
2+<br/>都可满足TdT的活性需求。不同的阳离子辅酶会使TdT有不同的活性，以dATP加尾聚合为p(dA)4
‑
50为例，最终相对产率从高到低为Mg
2+
&gt;Zn
2+
&gt;Co
2+
&gt;Mn
2+
。末端转移酶在Mg
2+
存在的条件下，选择3
’‑
OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在CO
2+
存在的条件下，选择3
’‑
OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。
[0004]在正常情况下，TdT仅存在于胸腺和骨髓中，在胸腺细胞中浓度最高。根据这一观察，有人假设TdT在免疫分化中发挥作用，至少在T细胞系列中如此。同时TdT存在于淋巴细胞白血病细胞中。TDT不仅在免疫系统中具有重要作用，而且对某些淋巴瘤的诊断也具有重要应用。TDT在淋巴母细胞淋巴瘤/白血病中阳性，是诊断淋巴母细胞淋巴瘤/白血病的重要依据之一。TdT在许多肿瘤、非肿瘤疾病中的表达均有指导意义，正确和充分认识TDT的表达谱，可使TDT阳性的肿瘤诊断更加精准。
[0005]TdT酶蛋白的常见应用有Tunel及RACE。Tunel(terminal deoxynucleotidyl transferase
‑
mediated dUTP
‑
biotin nick end labeling，原位末端转移酶标记技术)其原理为细胞在凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体的基因组DNA，此时DNA的3
‑
OH即会暴露出来，在TdT的催化下其会加上标记有FTIC标记的dUTP(fluorescein
‑
dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。5
’
RACE原理为(rapid
‑
amplification of cDNA ends)在使用基因特异性引物(GSP)与mRNA结合，并且逆转录生成特定的单链cDNA后，就需要使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)添加相同的字符串cDNA的3
’
端的核苷酸，称为均聚物尾巴。其中TdT的非模板依赖性至关重要，可以催化在单链DNA的3
’
羟基端加上dNTP，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补的即A和T、C和G的尾巴后，经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互补作用连接在一起)。在CDNA文库建立时，这种加尾
方法是使CDNA插人载体中的常用方法之一。关于TdT已有许多文献报告，大部分都集中在对TdT表达量高低及相应病理情况的研究TdT的相关应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种蛋白洗脱液。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供所述的蛋白洗脱液在纯化末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT中的应用。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法。
[0010]本专利技术的第四个目的是提供一种纯化末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的试剂盒。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0012]一种蛋白洗脱液，所述蛋白洗脱液中含有20～25mM咪唑、20～25mM Trisbase和0.4～0.5M NaCl，pH为7.0～8.0。
[0013]优选地，所述蛋白洗脱液中含有20mM咪唑、25mM Trisbase和0.5M NaCl，pH为8.0。
[0014]所述的蛋白洗脱液在纯化末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT中的应用。
[0015]一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法，具体包括以下步骤：
[0016]S1：菌株发酵：重组菌株，发酵，收集发酵产物，收集菌体，重悬菌体，破碎菌体，收集上清液；所述重组菌株为重组有重组载体的菌株，所述重组载体为pET
‑
28a载体的1526bp位置插有MBP
‑
TdT片段，所述MBP
‑
TdT片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0017]S2：第一次镍柱纯化：2～3倍柱体积的20～40mM咪唑平衡后，将步骤S1上清液上样，流速为5～10mL/min，上样后，使用30～40mM咪唑洗杂，洗杂流速4～10mL/min，洗杂后，使用所述的蛋白洗脱液将蛋白洗脱，得到蛋白溶液；
[0018]S3：TEV酶切，收集步骤S2得到的蛋白溶液，采用透析方式换液；
[0019]所述蛋白溶液与透析溶液的体积比为80～100：5000，搅拌换液3～10h；
[0020]重复一次；得到第二次换液的蛋白溶液，测定蛋白浓度，用TEV内切酶酶切蛋白，蛋白溶液与TEV内切酶的质量比为1：10，得到酶切后的蛋白溶液；
[0021]S4：第二次镍柱纯化，2～3倍柱体积的试剂平衡后，将步骤S3得到的酶切后的蛋白溶液以5～10mL/min的流速上样；淋洗2～5倍柱体积；使用20～25mM咪唑洗脱，监测A280 nm吸收峰，待峰值有明显升高时收集洗脱液，得到蛋白溶液；
[0022]S5：Q柱纯化，将步骤S4得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白洗脱液，其特征在于，所述蛋白洗脱液中含有20～25mM咪唑、10～25mM Trisbase和0.4～0.5M NaCl，pH为7.5～8.0。2.权利要求1所述的蛋白洗脱液在纯化末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT中的应用。3.一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1：菌株发酵：重组菌株，发酵，收集发酵产物，收集菌体，重悬菌体，破碎菌体，收集上清液；所述重组菌株为重组有重组载体的菌株，所述重组载体为pET
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28a载体的1526bp位置插有MBP
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TdT片段，所述MBP
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TdT片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；S2：第一次镍柱纯化：2～3倍柱体积的20～40mM咪唑平衡后，将步骤S1上清液上样，流速为5～10mL/min，上样后，使用30～40mM咪唑洗杂，洗杂流速4～10mL/min，洗杂后，使用权利要求1所述的蛋白洗脱液将蛋白洗脱，得到蛋白溶液；S3：TEV酶切，收集步骤S2得到的蛋白溶液，采用透析方式换液；所述蛋白溶液与透析溶液的体积比为80～100：5000，搅拌换液3～10h；重复一次；得到第二次换液的蛋白溶液，测定蛋白浓度，用TEV内切酶酶切蛋白，蛋白溶液与TEV内切酶的质量比为1：10，得到酶切后的蛋白溶液；S4：第二次镍柱纯化，2～3倍柱体积的试剂平衡后，将步骤S3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王绪德，杨畅，李信志，刘义，雷文龙，赵红洲，
申请(专利权)人：武汉赛维尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：