固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用，涉及中药活性成分筛选相关的技术领域。所述的光交联分子探针以三氟甲基苯基双吖丙啶作为光交联基团，通过含氧直链连接桥固定于氨基载玻片，在365nm紫外光照射下可与多种中药小分子结合构建光交联分子探针。本发明专利技术的光交联基团与载体间的距离通过含氧直链连接桥得以延长，增加了活性小分子与靶蛋白特异性结合的机率，活性小分子通过光亲和连接链固定于特制载体上，方便实现对“钓取”的靶标蛋白进一步的确证分析。本发明专利技术以非选择性的方式进行光交联反应，适用于成分复杂多样的中药及复方体系，应用于中药活性成分筛选领域，具有通量高、速度快、时效性强、易于实现的优点。易于实现的优点。易于实现的优点。

【技术实现步骤摘要】
固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用


[0001]本专利技术属于药物活性成分筛选相关的
，具体涉及一种固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]分子探针技术是从化学生物学角度发展起来的靶点研究技术，在基于活性的蛋白质谱分析和以化合物为中心的化学蛋白质组学中都发挥关键的作用，通过运用活性导向的探针分子在复杂的生物样品中特异性地标记靶标蛋白，从而对小分子与靶标蛋白的相互作用进行研究。光交联反应作为一种快速、简单和时效可控的交联工具广泛地应用于化学、生物、医学和材料等多个研究领域，将合成的光敏小分子化合物作为工具探针，在特定波长的光照射下，产生高活性的中间体，与其受体活性部位形成特异性的不可逆共价键结合的化学反应。
[0003]随着光学技术与生物医学的不断发展，光交联分子探针逐渐成为发现蛋白与小分子、生物大分子、蛋白或受体间相互作用的重要工具。光交联分子探针一般由活性分子、光交联基团、连接部位及报告基团组成，但在应用上存在诸多限制：对于结构复杂的天然小分子，化学修饰难度较大且无法进行充分的构效关系研究；化学标记后的小分子可能因化学性质的改变而与靶蛋白结合造成假阳性结果；构建的分子探针仅用于单一成分靶点的筛选，对于化学成分多样的中药而言需要极大的工作量；同时游离状态下的分子探针与靶蛋白结合后存在示踪困难，分离、鉴定步骤复杂繁琐等问题。基于以上问题，需要设计合成一种固定于特制玻片上的光交联分子探针，与相关疾病靶标蛋白共孵育后，借助现代光谱分析手段对其进行直接鉴定，用于探究中药复杂成分与蛋白质之间的相互作用以及针对特定靶标蛋白筛选中药活性成分。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术不足，提供一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法及应用，以获得结构和性能较优，固定于特定载体上的光交联分子探针，这种特殊的分子探针可与疾病靶标蛋白共孵育后检测玻片表面的蛋白质分子信号，实现药物活性成分的高通量筛选，也可利用光交联分子探针“钓取”更多可能与活性成分特异性结合的靶标蛋白，实现靶蛋白的富集，为发现药物治疗新靶标，进一步验证光交联分子探针技术在靶标蛋白确证方面提供可行性研究基础。本专利技术提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，包括以下步骤：
[0006](1)普通载玻片经(3
‑
氨丙基)三甲氧基硅烷处理得到氨基玻片；
[0007](2)将步骤(1)制得的氨基玻片与光亲和连接链孵育得到光亲和连接链负载的特制玻片；
[0008](3)将药物小分子化合物与步骤(2)得到的光亲和连接链负载的特制玻片进行光交联反应得到光交联分子探针。
[0009]进一步地，所述光亲和连接链为：
[0010]N
‑
[2
‑
[2
‑
(2
‑
Aminoethoxy)ethoxy]ethyl]‑4‑
[3
‑
(trifluoromethyl)
‑
3H
‑
diazirin
‑3‑
yl]benzamide；
[0011]结构式如下：
[0012][0013]进一步地，所述步骤(1)的具体过程为：
[0014]将普通载玻片表面清洗干净后置于玻片架上，浸入无水乙醇中浸泡过夜后用质量分数5～10％的氢氧化钠溶液浸泡1～3h，洗涤后放入质量分数0.5～1％HCl水溶液浸泡1～3h，再用纯水洗涤干燥。待玻片冷却至室温后与体积分数9％的(3
‑
氨丙基)三甲氧基硅烷甲醇溶液充分反应，经洗涤干燥冷却后得到氨基玻片。
[0015]进一步地，所述步骤(2)的具体过程为：将步骤(1)得到的氨基玻片插入装有玻片活化液的染色缸中，室温下振摇活化，得到活化后的玻片。将活化后的玻片用N,N
‑
二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片与含有N,N
‑
二异丙基乙胺和光亲和连接链的N,N
‑
二甲基甲酰胺溶液在室温黑暗干燥条件下孵育过夜，所述N,N
‑
二异丙基乙胺的浓度为50mM，所述光亲和连接链的浓度为10mM。依次用无水乙醇、N,N
‑
二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片放入装有封闭液的染缸中振摇，再用无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥后，得到特制玻片。
[0016]进一步地，所述玻片活化液为含有N,N'
‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯(10mM)与N,N
‑
二异丙基乙胺(10mM)的N,N
‑
二甲基甲酰胺溶液；封闭液为浓度为1M乙醇胺的N,N
‑
二甲基甲酰胺溶液；所述N,N
‑
二甲基甲酰胺均需要过分子筛并静置24h以上。
[0017]进一步地，所述步骤(3)的具体过程为：吸取10mM药物小分子化合物溶液点样1μL至特制玻片表面，将点样后的玻片干燥后，置于UV 365nm下照射3h，用甲醇淋洗，再依次用N,N
‑
二甲基甲酰、二氯甲烷、无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥玻片表面，得到光交联分子探针。
[0018]进一步地，所述步骤(2)和步骤(3)振摇频率为120～160r/min；所述步骤(2)和步骤(3)的实验操作在避光条件下进行，以保证光亲和连接链中三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团的稳定性。
[0019]进一步地，所述药物小分子化合物为皂苷类、黄酮类、木脂素类或糖类化合物。
[0020]本专利技术提出一种固定于特制玻片上的光交联分子探针，由上述方法制备得到。
[0021]本专利技术提出了一种固定于特制玻片上的光交联分子探针在药物活性成分筛选方面的应用。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]本专利技术通过使用以三氟甲基苯基双吖丙啶为光交联基团的光亲和连接链，将其固定于特定载体上后可与多种中药活性小分子结合构建光交联分子探针，通过与疾病相关靶
标蛋白共孵育实现中药活性成分的高通量筛选。光亲和连接链中的三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团在黑暗条件下具有良好的稳定性，同时具有较好的光交联活性，在365nm紫外光照射下产生的高活性反应中间体卡宾不可逆地结合或插入到多种小分子的C(sp2)
‑
H、C(sp3)
‑
H、O
‑
H、N
‑
H化学键发生反应，通量高、速度快、适用性强。
[0024]本专利技术中光交联基团与载体间的距离通过含氧直链连接桥得以延长同时增加了亲水性。进一步地，本专利技术中光交联分子探针的制备过程选择具有良好化学稳定性和低挥发性的N,N
‑
二甲基甲酰胺作为溶剂，减少对实验人员及环境的危害，其余本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)普通载玻片经(3
‑
氨丙基)三甲氧基硅烷处理得到氨基玻片；(2)将步骤(1)制得的氨基玻片与光亲和连接链孵育得到光亲和连接链负载的特制玻片；(3)将药物小分子化合物与步骤(2)得到的光亲和连接链负载的特制玻片进行光交联反应得到光交联分子探针。2.根据权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述光亲和连接链为：N
‑
[2
‑
[2
‑
(2
‑
Aminoethoxy)ethoxy]ethyl]
‑4‑
[3
‑
(trifluoromethyl)
‑
3H
‑
diazirin
‑3‑
yl]benzamide；结构式如下：3.根据权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体过程为：将普通载玻片表面清洗干净后置于玻片架上，浸入无水乙醇中浸泡过夜后用质量分数5～10％的氢氧化钠溶液浸泡1～3h，洗涤后放入质量分数0.5～1％HCl水溶液浸泡1～3h，再用纯水洗涤干燥。待玻片冷却至室温后与体积分数9％的(3
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氨丙基)三甲氧基硅烷甲醇溶液充分反应，经洗涤干燥冷却后得到氨基玻片。4.根据权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体过程为：将步骤(1)得到的氨基玻片插入装有玻片活化液的染色缸中，室温下振摇活化，得到活化后的玻片。将活化后的玻片用N,N
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二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片与含有N,N
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二异丙基乙胺和光亲和连接链的N,N
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二甲基甲酰胺溶液在室温黑暗干燥条件下孵育过夜，所述N,...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，陈若雨，谢建辉，颜继忠，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：