D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用技术

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【技术实现步骤摘要】
D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用

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[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶的制备方法，及其在转化D
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阿洛酮糖方面的应用。

技术介绍
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[0002]D
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阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量甜味剂。因具有较高的甜度和较低的能量，D
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阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品，可用于开发低热量食品饮料。同时，D
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阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质，可以完美发挥传统的糖的作用。
[0003]生物合成法生产D
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阿洛酮糖，是利用微生物所产特异性的酶，专一性的催化底物合成D
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阿洛酮糖。D
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阿洛酮糖
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差向异构酶(D
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allulose
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epimerase，DAE)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，以D
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果糖为底物生产附加产值高的D
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阿洛酮糖。随着D
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阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，高效的生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。然而，D
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阿洛酮糖3
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异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖过程中，由于酶无法重复利用，使得该工艺成本较高，且水溶性的酶不易从反应系统中分离出来，不利于控制和自动化生产。酶的固定化技术可以增加酶稳定性的同时使酶可以反复多次使用，但是传统的酶固定化方式容易导致酶多个位点和载体结合，破坏酶的天然构象或者出现位阻效应而阻碍底物进入到酶的活性位点，致使固定化酶活性大幅度下降。

技术实现思路
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[0004]鉴于以上问题，本专利技术的目的在于提供一种D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶固定化酶的方法，包括用于固定化酶制备的蛋白质，使得制备的固定化酶能够在保持较高酶活性的同时维持良好的稳定性，实现批次循环使用。
[0005]本专利技术技术方案具体如下：
[0006]本专利技术提供一种利用相互作用多肽对SpyTag/SpyCatcher，或SnoopTag/SnoopCatcher制备D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶固定化酶的方法，包括如下步骤：
[0007]1)向磷酸钠缓冲液中加入SpyCatcher或SnoopCatcher，之后加入适量环氧树脂，25℃恒温振荡反应12h，反应产物用PBS缓冲液洗涤数次；
[0008]2)将洗涤后的反应产物加入甘氨酸缓冲液中，25℃恒温振荡反应12～24h，反应产物用超纯水清洗数次；
[0009]3)将清洗后的反应产物加入磷酸钠缓冲液中，之后加入可与所述SpyCatcher专一结合的多肽SpyTag或可与所述SnoopCatcher专一结合的多肽SnoopTag，25℃恒温搅拌反应3～12h，获得D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶固定化酶；
[0010]其中，多肽对SpyCatcher/SpyTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；多肽对SnoopCatcher/SnoopTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0011]进一步地，步骤1)中，所述SpyCatcher或SnoopCatcher与所述环氧树脂的加量比例按质量比为：每20～35mg蛋白对应加入1g环氧树脂；步骤3)中，所述清洗后的反应产物与所述SpyTag或SnoopTag的加量比例按摩尔比为1:1。
[0012]进一步地，步骤1)中，所述环氧树脂经过如下预处理：将环氧树脂置于磷酸钾缓冲液中，25℃恒温下150rpm振荡1h，振荡处理重复2～3次，最后用超纯水清洗环氧树脂；用于对所述环氧树脂进行预处理的磷酸钾缓冲液由0.1mol/L的K2HPO4和0.1mol/L的KH2PO4按体积比15～16:1混合配制而成。
[0013]进一步地，步骤2)中甘氨酸缓冲液的浓度为3mol/L，pH为7.4；步骤1)和步骤3)中的所述磷酸钠缓冲液的浓度为2mol/L，pH为6.4～7.4；步骤1)中用于洗涤反应产物的PBS缓冲液的pH为7.4。
[0014]在此基础上，本专利技术提供一种利用D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶制备D
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阿洛酮糖的方法，具体步骤如下：
[0015]1)将固定化酶加入到含有D
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果糖的反应体系中，于50～60℃反应1.5～2.5h；反应体系中的D
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果糖浓度为100～500g/L；反应体系中固定化酶的催化剂用量为：每20～25g D
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果糖对应加入0.01g固定化酶；
[0016]2)反应完成后，用pH7.4的PBS缓冲液洗涤固定化酶，之后将固定化酶置于pH7.4的PBS缓冲液中，4℃保存备用。
[0017]进一步地，步骤1)中，所述含有D
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果糖的反应体系为水果自发酵液，其D
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果糖的浓度为100g/L。
[0018]本专利技术提供的可相互作用的多肽SpyTag/SpyCatcher，以及SnoopTag/SnoopCatcher，较之常规的Tag
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Catcher蛋白组装体系可以在体外特异性地自组装形成更稳定的共价键，充分满足固定化酶的结合程度和活性位点要求，利用该特性制备获得的D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶同时保持了酶活高和稳定性高的特点，重复多次使用后酶活无明显衰减。同时，利用本专利技术提供的多肽对进行D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶的制备，过程中无需使用戊二醛(交联)及其它有毒害的化学试剂，同时也不涉及昂贵的试剂和复杂的设备，整个制备过程无毒害且成本低廉。
附图说明：
[0019]图1为SpyCatcher核苷酸序列的扩增产物电泳结果，图中泳道1中的条带对应SpyCatcher的DNA分子，泳道M为Marker条带。
[0020]图2为SpyTag核苷酸序列的扩增产物电泳结果，图中泳道1、2中的条带对应SpyTag的DNA分子，泳道M为Marker条带。
[0021]图3为SnoopCatcher核苷酸序列的扩增产物电泳结果，图中泳道1中的条带对应SnoopCatcher的DNA分子，泳道M为Marker条带。
[0022]图4为SnoopTag核苷酸序列的扩增产物电泳结果，图中泳道1～3中的条带对应SnoopTag的DNA分子，泳道M为Marker条带。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用相互作用多肽对制备D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶的方法，包括如下步骤：1)向磷酸钠缓冲液中加入多肽SpyCatcher或SnoopCatcher，之后加入适量环氧树脂，25℃恒温振荡反应12h，反应产物用PBS缓冲液洗涤数次；2)将洗涤后的反应产物加入甘氨酸缓冲液中，25℃恒温振荡反应12～24h，反应产物用超纯水清洗数次；3)将清洗后的反应产物加入磷酸钠缓冲液中，之后加入可与所述SpyCatcher专一结合的多肽SpyTag或可与所述SnoopCatcher专一结合的多肽SnoopTag，25℃恒温搅拌反应3～12h，获得D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶；其中，多肽对SpyCatcher/SpyTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；多肽对SnoopCatcher/SnoopTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。2.根据权利要求1所述的制备D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶的方法，其特征在于：步骤1)中，所述SpyCatcher或SnoopCatcher与所述环氧树脂的加量比例按质量比为：每20～35mg蛋白对应加入1g环氧树脂；步骤3)中，所述清洗后的反应产物与所述SpyTag或SnoopTag的加量比例按摩尔比为1:1。3.根据权利要求1所述的制备D
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阿洛酮糖
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差向异构酶固定化酶的方法，其特征在于：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦慧民，路福平，高鑫，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：