甘露聚糖酶的固定化及在酶反应器中的应用制造技术

本发明专利技术公开了甘露聚糖酶的固定化及在酶反应器中的应用。按照甘露聚糖酶与载体质量比为1:1取料，加入0.1M pH＝5的磷酸盐缓冲液，在25℃固定化反应24h制成。本发明专利技术选用树脂固定化载体对甘露聚糖酶进行固定化处理，考察其最佳固定化条件；并利用该固定化酶制备酶反应器，使用该反应器制备甘露寡糖，从而实现了酶重复利用(15批次以上)，解决了反应底物粘度大的缺点，为降低甘露寡糖生产成本奠定技术基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
甘露聚糖酶的固定化及在酶反应器中的应用


[0001]本专利技术属于甘露寡糖制备
，具体涉及甘露聚糖酶的固定化及在酶反应器中的应用。

技术介绍

[0002]甘露寡糖是指由2
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10个甘露糖通过β
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1，4糖苷键连接而成的寡糖,最早从酵母培养细胞壁中提取的一类新型抗原活性物质，广泛存在于魔芋粉、瓜儿豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁内。甘露寡糖具有性质稳定、低热量、不引发龋齿、降血糖等特点，因此作为新一代功能食品配料在食品行业被广泛的应用。
[0003]目前，甘露寡糖是以甘露聚糖如魔芋粉、槐豆胶、咖啡渣等原料制备而来。制造方法是酶分解、化学方法和物理方法等，由于酶法制备的低污染、反应温和等优点，已经开始广泛应用。但由于采用液酶反应不能进行回收重复利用，去除液酶时多采用高温处理，这一处理将影响产品的色度；同时液酶成本较高，这些因素限制了酶法制备甘露寡糖的发展。为了解决这一问题，研究人员开展固定化甘露聚糖酶研究。专利CN105274163A提供一种利用红茶茶叶渣同氏木霉孢子混合制备甘露糖，该方法制备复杂，并且未提及反应批次；专利CN105524911A提供一种利用纳米纤维材料制备固定化甘露聚糖酶用于制备甘露寡糖的方法，该方法使用固定化酶同底物混合反应，底物同酶分离较复杂，并且未提及实际使用批次，并不能体现固定化酶的优势；专利CN101492667A提供一种利用利用微孔滤膜固定化产酶微生物细胞的方法，利用该固定化细胞进行了4
‑
8次连续反应，其相对酶活力由最初的200％降低到50％，这大大限制了其实际应用；专利CN102586219A提供一种利用吸附大孔树脂制备固定化甘露聚糖酶，并应用到制备芦荟多糖的降解，但该方法也未提及在瓜尔胶等多聚糖中的应用，并且未提及使用批次。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供甘露聚糖酶的固定化及在酶反应器中的应用。
[0005]一种固定化甘露聚糖酶，采用LX
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103B、LX
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1000HA(A)、LX
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HFA001、LX1000HFA、LX
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1000EA、LKZ126、LKZ618 ES
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101、ESR
‑
1为固定化载体制备，优选LX
‑
HFA001作为酶固定化载体。
[0006]所述固定化甘露聚糖酶的制备方法，按照甘露聚糖酶与载体质量比为1:1取料，加入0.1M pH＝5的磷酸盐缓冲液，在25℃固定化反应24h。
[0007]所述磷酸盐缓冲液的加入量为甘露聚糖酶与载体质量的20
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30倍。
[0008]优选的，所述磷酸盐缓冲液的加入量为甘露聚糖酶与载体质量的25倍。
[0009]所述固定化甘露聚糖酶在酶反应器中的应用。
[0010]以瓜尔胶浓度1％，pH5.5，在温度条件45℃，固定化甘露聚糖酶液(反应液)20mL/min流速循环反应6h，制备甘露寡糖，反应批次可达15批次以上。
[0011]本专利技术的有益效果：本专利技术选用固定化载体LX
‑
HFA001，对甘露聚糖酶进行固定化
处理，考察其最佳固定化条件；并利用该固定化酶制备酶反应器，使用该反应器制备甘露寡糖，从而实现了酶重复利用，解决了反应底物粘度大的缺点，为降低甘露寡糖生产成本奠定技术基础。
附图说明
[0012]图1为甘露寡糖标准曲线。
[0013]图2为不同载体固定化酶甘露聚糖酶酶活的影响。
[0014]图3为不同缓冲液pH对固定化酶甘露聚糖酶酶活的影响。
[0015]图4为不同温度对固定化酶甘露聚糖酶酶活的影响。
[0016]图5为不同加酶量对固定化酶甘露聚糖酶酶活的影响。
[0017]图6为不同固定化时间对固定化酶甘露聚糖酶酶活的影响。
[0018]图7为固定化酶反应器流程。
[0019]图8为酶反应器酶解制备甘露寡糖浓度变化。
[0020]图9为反应温度对制备甘露寡糖的影响。
[0021]图10为反应pH对制备甘露寡糖的影响。
[0022]图11为底物浓度对制备甘露寡糖的影响。
[0023]图12为酶反应器反应批次酶活变化。
具体实施方式
[0024]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0025]下述实施例中所用溶液配制如下：
[0026]醋酸溶液：准确称取醋酸溶液0.6mL，再加去离子水稀释至100mL。
[0027]醋酸钠溶液：准确称取1.36g的三水乙酸钠结晶，再加去离子水溶解至100mL。
[0028]醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液：准确称取23.14g三水乙酸钠结晶，再加入1.7mL的冰乙酸溶液，加去离子水溶解至2000mL，量筒定容。测定溶液的pH值，若pH偏离5.5，则用上述醋酸溶液或是醋酸钠溶液调至5.5为止。
[0029]1mg/mL甘露糖储备液的配置：精确称取1g D
‑
甘露糖，加入少量醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液溶解后定容至1L。
[0030]底物的配制：称取0.6000g瓜儿豆胶，精确到0.001g，加入大约70mL的醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液，磁力混合并加热间隔，直到瓜儿豆胶完全溶解，继续搅拌15分钟，量筒定容至100mL，放入烧杯中，四周包上锡纸，遮光置于4℃冰箱保存。
[0031]0.05M的磷酸盐，称取NaH2PO4，0.78g，Na2HPO4，1.79g，溶于100mL的去离子水中，使用磷酸调pH为7。
[0032]0.1M的磷酸盐，称取NaH2PO4，1.56g，Na2HPO4，3.58g，两个盐分别溶于100mL的去离子水中，调pH为7。
[0033]0.2M磷酸盐的配置，称取NaH2PO4，0.12g，Na2HPO
4 0.44g，溶于100mL液酶中，调pH为7。
[0034]酶活测定方法如下：
[0035]甘露聚糖标曲的测定：标曲的测定一般是依照以下数据进行稀释到0.1
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0.7mg/mL的D
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甘露糖标准溶液。
[0036]表1标准曲线的测定
[0037][0038]每一种D
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甘露糖各吸收200μL，加入200μL醋酸
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醋酸钠溶液和500μLDNS试剂，在沸水浴的条件下加热5min，然后用流动的冷水快速让混合液冷却到室温，再加入去离子水，使之定容到2.5mL进行轻摇混匀，在分光光度计540nm的条件下用对照溶液调零，准备测定吸光值。做出的数据图表中，以D
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甘露糖浓度作为Y轴，以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化甘露聚糖酶，其特征在于，采用LX
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103B、LX
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1000HA(A)、LX
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HFA001、LX1000HFA、LX
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1000EA、LKZ126、LKZ618 ES
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101、ESR
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1为固定化载体制备。2.权利要求1所述固定化甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，按照甘露聚糖酶与载体质量比为1:1取料，加入0.1M pH＝5的磷酸盐缓冲液，在25℃固定化反应24...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘力强，张伟，谷雅文，曹毅，武建，刘燕静，袁江宏，袁润，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：