一种基于SNP研究玉米南方锈病群体遗传和传播的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于SNP标记研究玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法。本申请的方法使用筛选出的限制性内切酶EcoRI和MspI酶切不同菌株DNA，以简化基因组测序技术，利用Stacks软件挖掘SNP标记，进而对多堆柄锈菌群体遗传结构和传播路径进行研究；本发明专利技术的限制性内切酶EcoRI和MspI对多堆柄锈菌全基因组切割效果较好，相较于其他组合，在测序深度相同的情况下，能获得更多的标签数。目前尚未对多堆柄锈菌全基因组测序，本发明专利技术以简化基因组测序并利用stacks软件获得不同菌株的SNP位点，并基于此研究多堆柄锈菌的群体遗传结构和传播路径的方法，对病害综合治理和精准防治有重要意义。要意义。要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于SNP研究玉米南方锈病群体遗传和传播的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域和遗传分析领域，具体地，本申请提供了一种基于SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法及其应用。

技术介绍

[0002]玉米南方锈病是由多堆柄锈菌引起的，是一种世界性的病害。该病害已在多个国家大暴发，导致了严重的产量损失。目前，该病害在我国海南、广东、广西、湖南、浙江、福建、江西、云南、贵州、重庆、四川、安徽、江苏、河南、湖北、河北、天津、北京、山西、陕西和辽宁等省份均有发生。我国种植的主要玉米品种，如郑单958、浚单20和先玉335，均对该病害均表现为高感。该病于2015年在我国大暴发，造成756万吨的玉米产量损失。该病害在我国具有发生面积大、发病速度快和远距离传播等特点，加大了该病在我国的防控难度。
[0003]多堆柄锈菌的夏孢子能够通过气流进行远距离传播。我国玉米南方锈病由南向北依次发生，因此，我国南方地区玉米上的多堆柄锈菌极有可能是北方夏玉米区的菌源。通过群体遗传学方法推断多堆柄锈菌的菌源中心以及传播路径，对该病的防控具有重要意义。
[0004]世界上应用群体遗传学方法研究多堆柄锈菌的群体结构和推断传播路径的研究极少。主要是因为分子遗传标记的匮乏。研究病原菌群体遗传的最有效的标记是SSR标记(简单重复序列标记)和SNP标记(单核苷酸多态性)。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。
[0005]目前没有发现多堆柄锈菌SNP标记的报道。研究多堆柄锈菌群体遗传，前人使用的标记有SSR、RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)和ISSR(简单重复序列区间标记)。在日本，Hirayae等(1998)利用ITS1和ITS2区域的RFLP标记研究采自日本的14个多堆柄锈菌菌株，发现在日本至少有2个群体。在泰国，Unartngam等(2011)利用5对ISSR标记对采自泰国8个省份的38个菌株进行分析，发现该38个菌株被划分为了13个群体。郭云艳等(2013)使用18对ISSR引物对我国12个省份的72个菌株进行群体遗传分析，发现72个菌株被划分为2个群5个亚群和10个组，菌株群体间存在较高的遗传变异。Sun等(2021)利用9对SSR标记对我国广东省的多堆柄锈菌进行群体遗传学分析，发现该地区的菌为克隆群体，且阳江市的多堆柄锈菌具有较高的遗传多样性。
[0006]与其他标记相比，SNP标记为共显性标记，有利于基因分型，且具有在基因组中数量多，分布广泛和高度稳定等特点。针对SNP标记，开发了一系列分子生物学相关的软件，易于进行自动化分析，缩短了研究的时间。因此SNP标记被广泛应用在分子生物学研究。应用SNP标记技术研究多堆柄锈菌群体遗传结构和推测该病在我国的传播规律，将对我国玉米南方锈病在我国的综合治理就有重要意义。

技术实现思路

[0007]针对以上情况，专利技术人筛选出了一对能获得较多片段的限制性内切酶组合(EcoRI和MspI)，使用该酶对多堆柄锈菌全基因组酶切后，对酶切片段进行简化基因组测序(GBS)，
使用Stacks软件对测序数据分析，挖掘SNP标记，利用SNP标记，对多堆柄锈菌进行群体遗传学研究。
[0008]一方面，本申请提供了一种基于SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法，其特征在于，包括酶切多个多堆柄锈菌菌株的DNA；测序；发掘SNP标记；利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径。
[0009]进一步地，所述测序为简化基因组测序(GBS)。
[0010]进一步地，所述测序在NovaSeq 6000平台上进行。
[0011]进一步地，所述发掘SNP标记中使用Stacks软件对测序数据分析。
[0012]进一步地，所述酶切使用EcoRI和MspI内切酶组合。
[0013]进一步地，所述利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径包括遗传多样性分析、群体分化指数Fst分析和/或群体遗传结构与传播分析。
[0014]另一方面，本申请提供了上述方法在如下(A)
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(H)任一项中的应用：
[0015](A)在多堆柄锈菌群体遗传学中的应用；
[0016](B)在多堆柄锈菌遗传结构分析中的应用；
[0017](C)在多堆柄锈菌遗传多样性分析中的应用；
[0018](D)在多堆柄锈菌群体分化分析中的应用；
[0019](E)在玉米南方锈病菌源中心确定中的应用；
[0020](F)在确定玉米南方锈病病原菌传播途径中的应用；
[0021](G)在玉米南方锈病防治中的应用；
[0022](H)在玉米南方锈病病原菌检测中的应用。
[0023]另一方面，本申请提供了EcoRI和MspI内切酶组合在发掘锈菌目SNP位点中的应用。
[0024]进一步地，所述锈菌为多堆柄锈菌。
[0025]本申请中所述的多堆柄锈菌为玉米南方锈病病原菌，其拉丁名为Puccinia polysora，也被成为多堆柄锈菌。
[0026]本专利技术的有益效果：
[0027]本专利技术筛选出了一对限制性内切酶组合(EcoRI和MspI)，通过对多堆柄锈菌全基因组酶切后，对酶切片段进行简化基因组测序，使用Stacks软件对测序数据分析，挖掘SNP标记，利用SNP标记，对多堆柄锈菌进行群体遗传学研究。该方法能够有效从分子水平上确定该菌在我国的传播路径，推测菌源中心，对我国玉米南方锈病的综合治理，减少产量损失和农药使用量具有重要意义。
附图说明
[0028]图1显示不同K值对应的CV error值分布图(A)和广东、广西和海南省多堆柄锈菌的群体遗传结构(B)。
具体实施方式
[0029]实施例1限制性内切酶的筛选
[0030]对我国海南、广东和广西的多堆柄锈菌进行采样，将采集的多堆柄锈菌样品带回
实验室。挑取单孢子堆进行单孢分离和培养获得单孢系(菌株)，具体方法参考本课题组申请的专利技术专利(一种玉米多堆柄锈菌的单孢扩繁方法，专利号：ZL201510765142.1)，通过扩繁，每个单孢系获得大量夏孢子。提取一个单孢系的DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。使用不用限制性内切酶组合对DNA进行酶切，酶切后的每个样品取5ul进行跑胶检测，要求DNA酶切完全，即酶切结束后没有主条带；250
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1000bp之间有明显弥散的条带。对上述DNA片段进行PCR扩增，富集测序文库模板，并且连接上测序接头。然后采用磁珠纯化PCR产物；对纯化后的PCR产物在NovaSeq 6000平台上进行双末端测序，测序片段长度为150bp(脱氧核糖核苷酸)。统计不同测序深度的每个标记(序列片段)的数量(表1)。发现EcoRI和MspI在相同测序深度的情况下，获得更多的序列片段数。更多的序列片段可以充分代表玉米多堆柄锈菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法，其特征在于，包括酶切多个多堆柄锈菌菌株的DNA；测序；发掘SNP标记；利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序为简化基因组测序。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述测序在NovaSeq 6000平台上进行。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述发掘SNP标记中使用Stacks软件对测序数据分析。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶切使用EcoRI和MspI内切酶组合。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径包括遗传多样性分析、群体分化指数Fst分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：马占鸿，孙秋玉，高建孟，黄莉群，李磊福，张克瑜，董佳玉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：