一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法技术

本发明专利技术公开了一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，包括如下步骤：S1、从对虾养殖塘的水体或土壤中提取核酸；S2、从受到EHP感染的虾肉组织中提取阳性样本，采用PCR体系扩增EHP目的片段，并按梯度稀释进行定量PCR反应，获取不同梯度的Ct平均值，确定临界对照Ct值；S3、对提取的核酸样本进行定量PCR检测，获取荧光定量PCR扩增曲线；S4、将步骤S3的检测结果与步骤S2中的临界对照Ct值进行对比。本发明专利技术可以针对养殖户的养殖环境，进行虾肝肠胞虫的病原检测，而且使用定量pcr检测具有更加灵敏和准确的特点。和准确的特点。和准确的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法。

技术介绍

[0002]南美白对虾是目前世界上最重要的经济虾类之一，也是我国主要的水产养殖品种，具有巨大的经济效益。但是长期以来，白对虾养殖产业一直受到多种传染性疾病的威胁，虾肝肠胞虫就是一种严重的传染性疾病。
[0003]感染虾肝肠胞虫(EHP)的对虾会出现生长缓慢的症状甚至停滞生长，严重的会慢性死亡。一旦虾肝肠胞虫大范围流行会造成白对虾养殖产业严重的减产，对养殖户造成巨大的经济损伤。目前,EHP已经在全世界各地的虾养殖场中被检测到,而EHP流行已经对印度、泰国、中国、越南、马来西亚、印度尼西亚等亚洲各国的养殖虾业造成了严重的经济损失。
[0004]目前在针对虾肝肠胞虫的研究中，尚无能够有效防治虾肝肠胞虫的报道。因而，为了避免造成经济损失，虾肝肠胞虫的预防就显得极为重要。在此为基础，发展出了以套式PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)为主的检测方法。而且在养殖过程中通过优先选育无虾肝肠胞虫亲虾和虾苗、投喂维生素增强对虾体质等手段减少EHP的危害。但是虾肝肠胞虫本身是一种真菌类寄生虫，容易在自然环境中长期存活，一旦有养殖户出现虾肝肠胞虫感染的情况，就疾病反复的现象。因而针对养殖户养殖环境的虾肝肠胞虫疾病检测就显得极为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，提供一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，以解决现有技术存在的技术问题。
[0006]为达成上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，包括如下步骤：
[0007]S1、从对虾养殖塘的水体或土壤中提取核酸；
[0008]S2、从受到EHP感染的虾肉组织中提取阳性样本，采用PCR体系扩增EHP目的片段，并按梯度稀释进行定量PCR反应，获取不同梯度的Ct平均值，确定临界对照Ct值；
[0009]S3、对步骤S1提取的核酸样本进行定量PCR检测，获取荧光定量PCR扩增曲线；
[0010]S4、将步骤S3的检测结果与步骤S2中的临界对照Ct值进行对比。
[0011]进一步地，所述步骤S1具体步骤如下：
[0012]a.将样品与0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液混匀；
[0013]b.在样本中加入溶菌酶，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min；
[0014]c.4℃冷藏，静置30min；
[0015]d.在样本中加20％SDS，振荡处理15min；
[0016]e.离心，取上清；
[0017]f.在上清液中加入等体积酚
‑
氯仿
‑
异戊醇，12000r
·
min
‑1离心10min，取上清液；
[0018]g.再加入等体积氯仿
‑
异戊醇，12000r
·
min
‑1离心10min，取上清液，重复该步骤1次；
[0019]h.加入0.6倍上清体积的异丙醇，
‑
20℃放置1h,12000r
·
min
‑1离心15min，弃去上清；
[0020]i.用70％乙醇清洗沉淀，12000r
·
min
‑1离心5min，弃去上清，晾干5
‑
10min，使用TE缓冲液溶解沉淀。
[0021]进一步地，所述步骤a中，所述样品为土样，步骤a具体为：称取土壤样品，加入0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液，振荡混匀。
[0022]进一步地，所述步骤a中，所述样品为水样，步骤a具体为：取水样，离心后弃去上清，用0.1mol/l PH8.0磷酸缓冲液重悬沉淀。
[0023]传统的水样提取方法一般采用PowerSoil DNA分离从过滤水样的滤纸上提取，对器材、试剂要求较高，成本也相对较高。而本申请通过溶菌酶
‑
SDS裂解的方法实现了水样提取，成本较低。
[0024]进一步地，所述步骤S2的具体步骤如下：
[0025]j.称取受到EHP感染的虾肉组织，置于1.5mL的EP管中，加入CTAB裂解液裂解，并于65℃水浴2h；
[0026]k.在样本中加等体积酚
‑
氯仿
‑
异戊醇，12000r
·
min
‑1离心10min，取上清液；
[0027]l.加等体积氯仿
‑
异戊醇，12000r
·
min
‑1离心10min，取上清液；
[0028]m.加0.6倍上清体积的异丙醇，
‑
20℃沉降1h,12000rpm离心15min，弃去上清；用70％乙醇清洗沉淀，12000r
·
min
‑
1离心3min，弃去上清，晾干5
‑
10min，使用TE缓冲液溶解沉淀DNA模板，在
‑
20℃保藏备用；
[0029]n.采用PCR体系扩增目的EHP SSU rRNA片段；
[0030]o.将步骤n中得到的目的片段用2％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收；使用第EHP SSU rRNA片段，按照梯度稀释进行定量PCR。
[0031]进一步地，所述步骤n中，PCR体系为：
[0032][0033]进一步地，所述步骤n中，扩增程序如下：
[0034][0035]进一步地，所述步骤o中，每个梯度为在上一个梯度的基础上稀释10倍。
[0036]进一步地，所述步骤S3中，PCR反应程序如下：
[0037]热启动：95℃
ꢀꢀꢀꢀ
10min；
[0038]循环：95℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15s，
[0039]ꢀꢀꢀꢀꢀ
60℃
ꢀꢀꢀ
30s，
[0040]共45个循环；
[0041]激活溶解曲线。
[0042]本专利技术与现有技术相对比，其有益效果在于：
[0043]1、本专利技术可以针对养殖户的养殖环境，进行虾肝肠胞虫的病原检测，而且使用定量pcr检测具有更加灵敏和准确的特点。
[0044]2、本专利技术提供了分别从土壤样本和水体中提取核酸的方法，使得取样方式更加多元化，增加了样本的多样性。
附图说明
[0045]图1是从水体和土壤中提取DNA的电泳结果。
[0046]图2是EHP阳性片段的扩增和回收的电泳结果。
具体实施方式
[0047]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过实施例本专利技术作进一步具体的说明。
[0048]实施例：一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，包括如下步骤：
[0049]S1、从对虾本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、从对虾养殖塘的水体或土壤中提取核酸；S2、从受到EHP感染的虾肉组织中提取阳性样本，采用PCR体系扩增EHP目的片段，并按梯度稀释进行定量PCR反应，获取不同梯度的Ct平均值，确定临界对照Ct值；S3、对步骤S1提取的核酸样本进行定量PCR检测，获取荧光定量PCR扩增曲线；S4、将步骤S3的检测结果与步骤S2中的临界对照Ct值进行对比。2.根据权利要求1所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤S1具体步骤如下：a.将样品与0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液混匀；b.在样本中加入溶菌酶，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min；c.4℃冷藏，静置30min；d.在样本中加20％SDS，振荡处理15min；e.离心，取上清；f.在上清液中加入等体积酚
‑
氯仿
‑
异戊醇，12000r
·
min
‑1离心10min，取上清液；g.再加入等体积氯仿
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异戊醇，12000r
·
min
‑1离心10min，取上清液，重复该步骤1次；h.加入0.6倍上清体积的异丙醇，
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20℃放置1h,12000r
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‑1离心15min，弃去上清；i.用70％乙醇清洗沉淀，12000r
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min
‑1离心5min，弃去上清，晾干5
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10min，使用TE缓冲液溶解沉淀。3.根据权利要求2所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，所述步骤a中，所述样品为土样，步骤a具体为：称取土壤样品，加入0.1mol/l PH 8.0磷酸缓冲液，振荡混匀。4.根据权利要求2所述的一种从养殖塘水土样本中检测虾肝肠胞虫的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永伟，金伟波，邱晴，黄雕，蒋文沁，唐玲燕，戚正梁，茅华华，陈夏月，阮关虎，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：