转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因玉米BBL2

【技术实现步骤摘要】
转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法


[0001]本专利技术涉及一种转基因材料的定量检测引物，特别涉及一种转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物及其检测方法。

技术介绍

[0002]自1983年第一例转基因植物问世以来，随着世界生物技术的迅速发展，全球转基因农作物种植面积逐年扩大，其产品安全性的关注度也不断提升。许多国家和地区颁布实施了转基因生物标识管理制度，针对转基因作物转化体建立特异、灵敏的定量检测方法是保证标识管理制度顺利实施的重要技术支撑。
[0003]玉米是全球种植的主要转基因作物之一，据国际农业生物技术应用署(International Service for the Acquisition of Agri
‑
biotech Applications，ISAAA)资料表明，2018年全球转基因玉米种植面积为14.39亿亩，总种植面积为17.96亿亩，转基因占比80.12％。我国是世界玉米生产和消费大国，对转基因玉米研发也取得了巨大进展，部分转基因材料已经具备商业化应用的潜力。转基因玉米BFL2
‑
2是由中国农业科学院生物技术研究所研发的抗虫耐除草剂玉米，抗草甘膦、抗鳞翅目和鞘翅目昆虫，目前已进入生产性试验阶段，具有极高的产业化应用潜力。到目前为止，国内外还没有用于转基因玉米BFL2
‑
2定量PCR检测的方法，制定转基因玉米BFL2
‑
>2检测的定量方法对于我国转基因生物安全监管、促进我国玉米产业的健康发展具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是提供用于检测转基因玉米BBL2
‑
2的转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物和探针；
[0005]所述特异性检测正向引物为：BBL2
‑2‑
qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物为：BBL2
‑2‑
qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
[0006]与其匹配的探针为：BBL2
‑2‑
P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示。
[0007]本专利技术的目的之二是建立一种转基因玉米BBL2
‑
2的转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，按照如下步骤进行：
[0008](1)提取待测样品DNA；
[0009](2)以提取的水稻样品的DNA为模板，同时设置玉米内标准基因和转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR反应体系，对标准梯度样品和待测样品进行检测；
[0010](3)运行实时荧光定量PCR反应，若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明待测样品中不含有转基因玉米BBL2
‑
2品系；
[0011](4)若转化体特异性实时荧光PCR反应体系扩增出荧光信号，则证明样品中含有转基因玉米BBL2
‑
2，根据标准梯度样品读取的荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线Ct＝k
×
Lg(Copies)+b，分别得到一条外源基因标准曲
线方程和一条内标准基因标准曲线方程，再将待测样品的Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数，然后按下述公式计算转基因含量：样品中转基因玉米BBL2
‑
2的含量％＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数
×
100。
[0012]所述BBL2
‑
2水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为：无菌水8μL，2
×
TaqMan反应缓冲液12.5μL，10μmol/L BBL2
‑2‑
qF1μL，10μmol/L BBL2
‑2‑
qR1μL，10μmol/L BBL2
‑2‑
P0.5μL，DNA模板2μL。
[0013]所述实时荧光PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，15s，60℃，60s，40个循环。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术采用实验的方法，对转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物探针进行特异性筛选，并配合使用玉米内标准基因zSSIIb，不仅能够定性检测样品中是否含有转基因玉米BBL2
‑
2，还能定量检测其含量。
附图说明
[0015]图1是引物探针优化扩增曲线图。
[0016]图2是特异性测试扩增曲线图。
[0017]图3是线性区间测试结果：1、标准品S1(20000拷贝)；2、标准品S2(4000拷贝)；3、标准品S3(800拷贝)；4、标准品S4(160拷贝)；5、标准品S5(32拷贝)；6、标准品S6(16拷贝)。
[0018]图4是检出限测试结果。
[0019]图5是内标准基因zSSIIb定量PCR图谱：1、标准品S1；2、标准品S2；3、标准品S3；4、标准品S4；5、标准品S5；6、正确度样品5％；7、正确度样品2％；8、正确度样品0.5％。
[0020]图6是BBL2
‑
2转化体特异性序列定量PCR图谱：1、标准品S1；2、标准品S2；3、标准品S3；4、标准品S4；5、标准品S5；6、正确度样品5％；7、正确度样品2％；8、正确度样品0.5％。
具体实施方式
[0021]下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0022]下述实验采用如下所述的实验材料
[0023]1、植物材料
[0024]转基因玉米BBL2
‑
2纯合体，非转基因玉米郑58，特异性实验验证样品13种。
[0025]特异性实验验证样品设计如下：
[0026]1)阴性对照(郑58)。
[0027]2)阳性对照(转基因玉米BBL2
‑
2，质量分数为1％)。
[0028]3)其他转基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、DAS40278
‑
9、4114、MON87427、5307，含量各1％，以非转基因玉米为填充物)；
[0029]4)转基因大豆混合物(GTS40
‑3‑
2、MON89788、A5547
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127、A2704
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12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON8770本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性定量PCR检测引物，其特征在于，所述特异性检测正向引物为：BBL2
‑2‑
qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物为：BBL2
‑2‑
qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性定量PCR检测引物，与其匹配的探针为：BBL2
‑2‑
P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示。3.一种转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性的定量检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)提取待测样品DNA；(2)以提取的水稻样品的DNA为模板，同时设置玉米内标准基因和转基因玉米BBL2
‑
2转化体特异性实时荧光定量PCR反应体系，对标准梯度样品和待测样品进行检测；(3)运行实时荧光定量PCR反应，若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明待测样品中不含有转基因玉米BBL2
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2品系；(4)若转化体特异性实时荧光PCR反应体系扩增出荧光信号，则证明样品中含有转基因玉米BBL2
‑
2，根据标准梯度...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗朝华，宛煜嵩，金芜军，刘卫晓，董美，高进，黄卫红，文婷婷，孟丽霞，王迪，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：