截短的多价多元体制造技术

截短的多价多元体。本发明专利技术涉及一种包括两个或更多个结合域的截短的多价多元体，其中每个结合域结合不同抗原或表位，且其中此类结合域中的两个经由铰链区配对，其中该多元体缺乏CH2或CH3区。本发明专利技术进一步包括在其包括两个或更多个二硫桥键的相应C末端处或附近配对的两个多肽，其中所述多肽各自包括可变结合域，该可变结合域包括可变区，其中每个可变区结合相同或不同的抗原或结合抗原上的相同或不同的抗原或表位。抗原或表位。抗原或表位。

【技术实现步骤摘要】
截短的多价多元体
[0001]本申请是申请号为201980086682.3、专利技术名称为“截短的多价多元体”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2019年12月30日提交的PCT国际专利申请PCT/NL2019/050880进入中国国家阶段的申请。


[0002]本专利技术涉并具有在C末端经由铰链配对的两个或更多个结合域的多价多元体(multivalent multimer)，以及用于制备此类多价多元体的方法。本专利技术进一步涉及能够结合两个或更多个表位或抗原的多价多元体的组成多肽，其中此类多肽经由包括二硫桥键的共价键配对。

技术介绍

[0003]能够结合两种抗原或两个表位的多价抗体，诸如双特异性抗体是此项技术中已知的。此类多价结合蛋白可使用各种技术产生，此类技术包括细胞融合、化学缀合或重组DNA技术。
[0004]抗体通常包括四种蛋白质的多元体，该四种蛋白质包括两个一致重链及两个一致轻链，其中该重链包括一个可变域(VH)及三个恒定区(CH1、CH2、CH3)，且其中该轻链包括一个可变轻链域(VL)及一个恒定区(CL)。通常，该轻链经由非共价相互作用的影响以及经由二硫键与该重链配对。该两个重链在铰链区处经由二硫键且经由在该两个CH3域之间的界面中的氨基酸相互作用配对。VH与VL配对形成抗原结合域，且通常在VH及VL域中的三个表面环形成区，即互补决定区或CDR中发现变化。
[0005]此项技术中已知可结合两种不同抗原，或结合同一抗原内的两个不同表位的某些多价形式，诸如具有两个不同结合域的抗体，诸如双特异性抗体。此类形式可允许使用经校准的结合，该结合将允许该多价多元体选择性靶向表达两种抗原或表位的细胞或目标，诸如肿瘤细胞，而不靶向表达一种抗原的健康细胞或以较低水平靶向表达一种抗原的此类健康细胞。类似地，在多价多元体，诸如在双特异性抗体上具有两个不同结合域可允许结合不同抗原，由此可使用该多价多元体靶向单细胞上或两个相互作用的细胞上的抑制及刺激分子，使得该多价多元体的效应增强。多价形式也可用于使细胞，例如免疫调节细胞复位向，可使此类细胞复位向至肿瘤。
[0006]尽管此项技术中已描述某些多价抗体，但此项技术中仍需要新形式、及新连接子、以及用于制备此类形式的新方法，其允许高效地制造多价抗体形式，其中可容易地制备针对一组抗原的结合域并将其高效、稳定地转化成多价多元体，且其能够结合一大组抗原和表位，包括缺乏(部分或完全地)含CH2和/或CH3区的Fc区的此类形式。
[0007]产生缺乏Fc的多特异性形式，诸如F(ab
′
)2或F(ab
′
)n(其中n＝两个或更多个)形式可提供优于现有多特异性抗体的益处。例如，在可能希望经由靶向此类细胞和感兴趣的抗原来接合或复位向免疫调节细胞的情况下，此类靶向部分上Fc组分的存在可能在某些应用中不利地影响功效。
[0008]类似地，在较小尺寸优选的情况下，相较于全长形式，F(ab
′
)n多特异性形式可为所希望的，包括可能浸润物理肿瘤和/或提供较短半衰期，其中此类特征可有益于给药方案。重要的是，工程改造含有超过两个具有不同目标的结合域的F(ab
′
)n在传统上是耗时、低效和/或昂贵的。例如，此项技术中已知可经由多种方式产生F(ab
′
)2部分，此类方式各自具有缺点，其中目标是大量制造此类部分的均匀批料以用于治疗应用。
[0009]此项技术中已知的产生F(ab
′
)2的一种方式是通过化学方式实现。Nisonoff和Rivers在数十年前采用化学配对的制造。Nisonoff A，Rivers MM(1961)Arch Biochem Biophys 93：460。随后，已开发出使用同型双官能和异型双官能化学试剂的多种方法。到目前为止，归因于可经由此类化学方式制造的时间、成本、低数量和异质性，尚无化学方法能高效地或可行地用作开发治疗性多特异性F(ab
′
)n候选物的方法。类似地，此类化学合成F(ab
′
)n部分的方式还由于使用使该两个Fab域配对的合成方式而不利，该方式引起有关用于治疗应用的独立问题，以及制造问题。
[0010]例如，F(ab
′
)2可使用o
‑
PDM产生。抗体“A”的Fab
′
片段与o
‑
PDM反应，使得邻近二硫醇与o
‑
PDM(R)形成复合物，且一个SH基团结合至o
‑
PDM，并残留一个游离顺丁烯二酰亚胺基。Fab A
‑
o
‑
PDM与游离Fab
′“
B”片段反应，由此在两个Fab之间形成硫醚键。应注意，与这些合成产生方式相关的困难包括难以将此类物理纯化至均质，以及难以在不改变人类抗体铰链区情况下构建此类部分，而改变人类抗体铰链区会引起免疫原性和活体内稳定性的缺乏。
[0011]实际上，尽管此类人工抗体在2000年间就已产生且利用于化学方式配对的Fab进行了治疗各种类型癌症的临床试验，但包括其可行性缺乏在内的原因，该概念看来已经不再讨论。
[0012]产生F(ab
′
)2部分的另一种方式是经由用诸如木瓜蛋白酶的类非特异性蛋白酶部分蛋白水解消化IgG实行。此类酶可切割IgG抗体中含有使重链配对的二硫键以及在轻链与重链之间的二硫键位点下部的铰链区。此类技术有存在未消化的IgG、过度消化和缺乏再现性的问题。此类非特异性蛋白酶的使用还被用作一种经由消化全长抗体以裂解Fc而产生F(ab
′
)2部分的方式。这些技术还相当耗时且需要IgG特异性优化以及抑制蛋白酶或纯化Fab以防止其降解。另外，这些消化产生过度消化、不充分消化的部分的异质群，且缺乏有关裂解位点的精确性，使得使用此类部分进行研究和治疗应用不切实际。困难的是，控制木瓜蛋白酶消化以使仅上部铰链区裂解，且在替代性位点处不裂解，此可取决于所裂解抗体的结构及可挠性而发生。因此，对于某些应用而言，经由木瓜蛋白酶消化具有两个或更多个结合域的多价抗体是不适当且不可行的。类似地，已采用胃蛋白酶裂解抗体的下部铰链区，旨在获得完整F(ab
′
)2。利用胃蛋白酶的缺点与利用木瓜蛋白酶类似。
[0013]近来，文献中已描述能够裂解全长免疫球蛋白中远离Fc的部分以产生个别Fab部分或F(ab
′
)2的酶。已关于有限的表征应用描述此类酶，包括用于评价亲合力相对于亲和力的差异或分析给定多元体中组成部分的分子量或组成。
[0014]因此，需要具有两个或更多个人类可变区及连接子的多价抗原结合多元体的新颖且有用的形式，其用于制造截短的多价多元体，此类截短的多价多元体缺乏Fc的全部或一部分，具有天然(不以化学方式合成)铰链配对或桥连Fab区(F(ab
′
)n)且可高效地且均质地产生。本文描述了截短的多价多元体的产生，此类截短的多价多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多价多元体，包括三个或更多个结合域并且包括具有N末端和C末端的两个或更多个重链区，其中所述多元体包括使所述重链区中的两个在所述C末端处配对的铰链区。2.根据权利要求1所述的多价多元体，包括三个或更多个人类重链可变区，其中两个在所述铰链区处配对，其中所述配对包括一个或多个二硫桥键。3.根据权利要求1或2所述的多价多元体，其中每个重链区包括CH1域。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多价多元体，其中两个或更多个重链区包括共同可变区。5.根据权利要求1至3中任一项所述的多价多元体，其中所述两个或更多个重链区与人类轻链区配对，其中所述轻链区是共同轻链。6.根据权利要求5所述的多价多元体，其中所述共同轻链包括CL域。7.根据权利要求5或6所述的多价多元体，其中所述共同轻链包括SEQ ID NO：1的序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的多价多元体，其中所述多元体包括三个Fab域(Fab1、Fab2、Fab3)，其各自包括与含可变区(VL)和恒定区(CL)的轻链配对的含可变区(VH)和恒定区(CH1)的重链，其中Fab2与Fab3经由在Fab2的重链可变区和Fab3的CH1域处的连接子连接，并且其中所述Fab1和Fab3经由铰链配对，所述铰链包括在Fab1的重链和Fab3的重链的C末端处存在的至少两个二硫键。9.根据权利要求8所述的多价多元体，其中连接Fab2与Fab3的所述连接子包括SEQ ID NO：2
‑
25的序列或与所述SEQ ID No：2
‑
25具有至少约85％同一性的多肽。10.根据权利要求8至9中任一项所述的多价多元体，其中所述连接子的氨基酸序列包括天然存在的序列或包括来源于天然存在的序列的序列。11.根据权利要求10所述的多价多元体，其中所述连接子包括中间铰链区序列。12.根据权利要求10所述的多价多元体，其中所述连接子包括上部铰链序列和下部铰链序列。13.根据权利要求10所述的多价多元体，其中所述连接子包括螺旋形成序列。14.根据权利要求1至13中任一项所述的多价多元体，其中所述两个或更多个重链区的可变区特异性结合不同的表位。15.根据权利要求1至14中任一项所述的多价多元体，其中所述多元体结合至少两种不同抗原。16.一种制造多价多元体的方法，包括：用两种或更多种抗原对转基因动物免疫接种，所述转基因动物包括编码共同轻链可变区和未经重排的重链可变区的核酸；获得一组...

【专利技术属性】
技术研发人员：科内利斯，
申请(专利权)人：美勒斯公司，
类型：发明
国别省市：