用于改进的单链可变片段的材料和方法技术

本发明专利技术公开了用于改进的单链可变片段的材料和方法。材料和方法。材料和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改进的单链可变片段的材料和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求以下专利申请的权益：2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,897；2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,886；2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,882；2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,877；2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,865；2019年8月15日提交的美国临时专利申请号62/887,529；2019年8月15日提交的美国临时专利申请号62/887,527；2019年8月15日提交的美国临时专利申请号62/887,524；2019年8月15日提交的美国临时专利申请号62/887,519；以及2019年8月15日提交的美国临时专利申请号62/887,514，其各自以引用的方式全文并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请以引用的方式并入作为文本格式随本申请一起提交的序列表，该序列表的名称为“14620
‑
227
‑
228_SL.txt”，创建于2020年8月5日，大小为258,724字节。
1.

[0005]公开了用于改进的单链可变片段的材料和方法。
2.
技术介绍

[0006]抗原结合单链可变片段(scFv)是可以广泛用作治疗剂、成像剂、诊断剂或作为异源分子(诸如多特异性分子)的部分的模块。scFv的挑战之一是低稳定性和聚集趋势(综述于下列文献中：Worn和Pluckthun(2001)J Mol Biol 305:989
‑
1010；Rothlisberger等人，(2005)J Mol Biol 347:773
‑
789；Gross等人，(1989)Transplant Proc 21(1Pt 1):127
‑
130，Porter等人，(2011)J Cancer 2:331
‑
332；Porter等人，(2011)N Engl J Med 365:725
‑
733)。因此，需要可以任选地结合到多特异性分子和异源分子中的改进的scFv设计。
3.
技术实现思路

[0007]在一个方面，本公开提供了一种分离的单链可变片段(scFv)，其包含重链可变区(VH)、接头(L)和轻链可变区(VL)，其中该scFv包含
[0008]在结构保守的表面暴露的VH半胱氨酸(Cys)与第一L Cys之间的第一二硫键；
[0009]在结构保守的表面暴露的VL Cys与第二L Cys之间的第二二硫键；或者
[0010]在结构保守的表面暴露的VH Cys与第一L Cys之间的第一二硫键，以及在结构保守的表面暴露的VL Cys与第二L Cys之间的第二二硫键。
[0011]本公开还提供了一种分离的scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0012]该VH包含在结构保守的表面暴露的VH框架残基位置处的VH Cys，并且该L包含第一L Cys；
[0013]该VL包含在结构保守的表面暴露的VL框架残基位置处的VL Cys，并且该L包含第二L Cys；或者
[0014]该VH包含在结构保守的表面暴露的VH框架残基位置处的VH Cys，该VL包含在结构保守的表面暴露的VL框架残基位置处的VL Cys，并且该L包含第一L Cys和第二L Cys，其中VH Cys和第一L Cys能够形成二硫键并且VL Cys和第二L Cys能够形成二硫键。
[0015]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0016]该VH包含在H105处的Cys；
[0017]该VL包含在L42处的Cys；
[0018]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0019]该scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。
[0020]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0021]该VH包含在H105处的Cys；
[0022]该VL包含在L45处的Cys；
[0023]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0024]该scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。
[0025]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0026]该VH包含在H105处的Cys；
[0027]该VL包含在L39处的Cys；
[0028]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0029]该scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。
[0030]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0031]该VH包含在H5处的Cys；
[0032]该VL包含在L42处的Cys；
[0033]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0034]该scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。
[0035]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0036]该VH包含在H5处的Cys；
[0037]该VL包含在L45处的Cys；
[0038]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0039]该scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。
[0040]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0041]该VH包含在H5处的Cys；
[0042]该VL包含在L39处的Cys；
[0043]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0044]该scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。
[0045]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0046]该VH包含在H3处的Cys；
[0047]该VL包含在L42处的Cys；
[0048]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0049]该scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。
[0050]本公开还提供了一种scFv，其包含VH、L和VL，其中
[0051]该VH包含在H3处的Cys；
[0052]该VL包含在L45处的Cys；
[0053]该L包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7；并且
[0054]该scFv处于VL...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的单链可变片段（scFv），所述分离的scFv包含重链可变区（VH）、接头（L）和轻链可变区（VL），其中所述scFv包含：a)在结构保守的表面暴露的VH半胱氨酸（Cys）与第一L Cys之间的第一二硫键；b)在结构保守的表面暴露的VL Cys与第二L Cys之间的第二二硫键；或者c)在所述结构保守的表面暴露的VH Cys与所述第一L Cys之间的所述第一二硫键，以及在所述结构保守的表面暴露的VL Cys与所述第二L Cys之间的所述第二二硫键。2.一种分离的scFv，所述分离的scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在结构保守的表面暴露的VH框架残基位置处的VH Cys，并且所述L包含第一L Cys；b)所述VL包含在结构保守的表面暴露的VL框架残基位置处的VL Cys，并且所述L包含第二L Cys；或者c)所述VH包含在结构保守的表面暴露的VH框架残基位置处的所述VH Cys，所述VL包含在结构保守的表面暴露的VL框架残基位置处的所述VL Cys，并且所述L包含所述第一L Cys和所述第二L Cys，其中所述VH Cys和所述第一L Cys能够形成二硫键并且所述VL Cys和所述第二L Cys能够形成二硫键。3. 根据权利要求1或2所述的scFv，其中所述VH Cys与所述VL Cys之间的距离为约7
Å
至约9
Å
。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的scFv，其中所述VH Cys在H3、H5、H40、H43、H46或H105处，其中残基根据Chothia进行编号。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的scFv，其中所述VL Cys在L3、L5、L39、L42、L45、L100或L102处，其中残基根据Chothia进行编号。6.根据权利要求1至5中任一项所述的scFv，其中a)所述VH Cys在H105处并且所述VL Cys在L42处；b)所述VH Cys在H43处并且所述VL Cys在L100处；c)所述VH Cys在H3处并且所述VL Cys在L3处；d)所述VH Cys在H3处并且所述VL Cys在L5处；e)所述VH Cys在H3处并且所述VL Cys在L39处；f)所述VH Cys在H3处并且所述VL Cys在L42处；g)所述VH Cys在H3处并且所述VL Cys在L45处；h)所述VH Cys在H3处并且所述VL Cys在L100处；i)所述VH Cys在H3处并且所述VL Cys在L102处；j)所述VH Cys在H5处并且所述VL Cys在L3处；k)所述VH Cys在H5处并且所述VL Cys在L5处；l)所述VH Cys在H5处并且所述VL Cys在L39处；m)所述VH Cys在H5处并且所述VL Cys在L42处；n)所述VH Cys在H5处并且所述VL Cys在L45处；o)所述VH Cys在H5处并且所述VL Cys在L100处；p)所述VH Cys在H5处并且所述VL Cys在L102处；q)所述VH Cys在H40处并且所述VL Cys在L3处；
r)所述VH Cys在H40处并且所述VL Cys在L5处；s)所述VH Cys在H40处并且所述VL Cys在L39处；t)所述VH Cys在H40处并且所述VL Cys在L42处；u)所述VH Cys在H40处并且所述VL Cys在L45处；v)所述VH Cys在H40处并且所述VL Cys在L100处；w)所述VH Cys在H40处并且所述VL Cys在L102处；x)所述VH Cys在H43处并且所述VL Cys在L3处；y)所述VH Cys在H43处并且所述VL Cys在L5处；z)所述VH Cys在H43处并且所述VL Cys在L39处；aa) 所述VH Cys在H43处并且所述VL Cys在L42处；bb) 所述VH Cys在H43处并且所述VL Cys在L45处；cc) 所述VH Cys在H43处并且所述VL Cys在L102处；dd) 所述VH Cys在H46处并且所述VL Cys在L3处；ee) 所述VH Cys在H46处并且所述VL Cys在L5处；ff) 所述VH Cys在H46处并且所述VL Cys在L39处；gg) 所述VH Cys在H46处并且所述VL Cys在L42处；hh) 所述VH Cys在H46处并且所述VL Cys在L45处；ii) 所述VH Cys在H46处并且所述VL Cys在L100处；jj) 所述VH Cys在H46处并且所述VL Cys在L102处；kk) 所述VH Cys在H105处并且所述VL Cys在L3处；ll) 所述VH Cys在H105处并且所述VL Cys在L5处；mm) 所述VH Cys在H105处并且所述VL Cys在L39处；nn) 所述VH Cys在H105处并且所述VL Cys在L45处；oo) 所述VH Cys在H105处并且所述VL Cys在L100处；或者pp) 所述VH Cys在H105处并且所述VL Cys在L102处，其中残基根据Chothia进行编号。7.根据权利要求1至6中任一项所述的scFv，其中所述L包含衍生自免疫球蛋白（Ig）铰链区的连续氨基酸序列。8.根据权利要求7所述的scFv，其中所述Ig铰链区衍生自人Ig铰链区或非人Ig铰链区。9.根据权利要求8所述的scFv，其中所述Ig铰链区衍生自所述人Ig铰链区。10.根据权利要求9所述的scFv，其中所述人Ig铰链区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列C(X)
y
C（SEQ ID NO: 23），其中X是甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸（His）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、苯丙氨酸（Phe）、苏氨酸（Thr）、色氨酸（Trp）或酪氨酸（Tyr），并且y是1至3的整数。12. 根据权利要求11所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列C(X)
y
C（SEQ ID NO: 24），其中X是Gly、Ser或Pro，并且y是1至3的整数。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列CPC、CGC、
CSC、CPPC（SEQ ID NO: 1）、CGPC（SEQ ID NO: 28）、CPGC（SEQ ID NO: 29）、CGGC（SEQ ID NO: 30）、CSPG（SEQ ID NO: 31）、CPSC（SEQ ID NO: 32）、CSSC（SEQ ID NO: 33）、CGSC（SEQ ID NO: 34）、CSGC（SEQ ID NO: 35）、CPPPC（SEQ ID NO: 36）、CGPPC（SEQ ID NO: 37）、CPGPC（SEQ ID NO: 38）、CPPGC（SEQ ID NO: 39）、CGGPC（SEQ ID NO: 40）、CPGGC（SEQ ID NO: 41）、CGGGC（SEQ ID NO: 42）、CSPPC（SEQ ID NO: 43）、CPSPC（SEQ ID NO: 44）、CPPSC（SEQ ID NO: 45）、CSSPC（SEQ ID NO: 46）、CPSSC（SEQ ID NO: 47）、CSSSC（SEQ ID NO: 48）、CGSPC（SEQ ID NO: 49）、CPGSC（SEQ ID NO: 50）、CSGPC（SEQ ID NO: 51）或CPSGC（SEQ ID NO: 52）。14.根据权利要求1至13中任一项所述的scFv，其中所述L包含约14个至约19个氨基酸，诸如约14个、约15个、约16个、约17个、约18个或约19个氨基酸。15. 根据权利要求1至14中任一项所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列(X)
m
C(X)
y
C(X)
n
（SEQ ID NO: 25）；其中X是Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、leu、Lys、Phe、Thr、Trp或Tyr，m是6至9的整数，y是1至3的整数，并且n是4至6的整数。16. 根据权利要求15所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列(X)
m
C(X)
y
C(X)
n
（SEQ ID NO: 26）；其中X是Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Thr或Tyr，m是6至9的整数，y是1至3的整数，并且n是4至6的整数。17. 根据权利要求16所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列(X)
m
C(X)
y
C(X)
n
（SEQ ID NO: 27）；其中X是Gly或Pro，m是6至9的整数，y是1至3的整数，并且n是4至6的整数。18. 根据权利要求1至17中任一项所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7。19.根据权利要求1至18中任一项所述的scFv，其中所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。20. 根据权利要求1至18中任一项所述的scFv，其中所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。21.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H105处的Cys；b)所述VL包含在L42处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。22.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H105处的Cys；b)所述VL包含在L45处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。23.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H105处的Cys；b)所述VL包含在L39处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。24.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H5处的Cys；
b)所述VL包含在L42处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。25.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H5处的Cys；b)所述VL包含在L45处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。26.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H5处的Cys；b)所述VL包含在L39处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。27.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H3处的Cys；b)所述VL包含在L42处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。28.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H3处的Cys；b)所述VL包含在L45处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。29.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H3处的Cys；b)所述VL包含在L39处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VL
‑
L
‑
VH取向。30.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H43处的Cys；b)所述VL包含在L100处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。31.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H43处的Cys；b)所述VL包含在L102处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。32.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中
a)所述VH包含在H43处的Cys；b)所述VL包含在L5处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。33.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H43处的Cys；b)所述VL包含在L3处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。34.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H40处的Cys；b)所述VL包含在L100处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。35.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H40处的Cys；b)所述VL包含在L102处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。36.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H40处的Cys；b)所述VL包含在L5处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。37.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H40处的Cys；b)所述VL包含在L3处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。38.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H46处的Cys；b)所述VL包含在L100处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。39.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H46处的Cys；b)所述VL包含在L102处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。
40.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H46处的Cys；b)所述VL包含在L5处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。41.一种scFv，所述scFv包含VH、L和VL，其中a)所述VH包含在H46处的Cys；b)所述VL包含在L3处的Cys；c)所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6或7；并且d)所述scFv处于VH
‑
L
‑
VL取向。42. 根据权利要求21至41中任一项所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3。43. 根据权利要求21至41中任一项所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6。44. 根据权利要求21至41中任一项所述的scFv，其中所述L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7。45.根据权利要求1至44中任一项所述的scFv，其中所述scFv与第二分子缀合。46.根据权利要求45所述的scFv，其中所述第二分子是半衰期延长部分。47.根据权利要求46所述的scFv，其中所述半衰期延长部分是免疫球蛋白（Ig）、所述Ig的片段、Ig恒定区、所述Ig恒定区的片段、Fc区、转铁蛋白、白蛋白、白蛋白结合结构域或聚乙二醇。48.根据权利要求45所述的scFv，其中所述第二分子是细胞毒素剂或可检测标签。49.根据权利要求48所述的scFv，其中所述第二分子为抗体或其片段。50.根据权利要求49所述的scFv，其中所述scFv和所述抗体或其片段结合不同的抗原。51.根据权利要求45所述的scFv，其中所述第二分子是嵌合抗原受体（CAR）。52.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至51中任一项所述的scFv，以及药学上可接受的载剂。53.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至44中任一项所述的scFv。54.一种载体，所述载体包含根据权利要求53所述的多核苷酸。55.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求54所述的载体。56.一种产生根据权利要求1至44中任一项所述的scFv的方法，所述方法包括在产生所述scFv的条件下培养根据权利要求55所述的宿主细胞，以及纯化所述scFv。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。58.根据权利要求56所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。59.一种抗独特型抗体，所述抗独特型抗体与根据权利要求1至44中任一项所述的scFv结合。60.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至44中任一项所述的scFv。61.一种多特异性分子，所述多特异性分子包含根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：