一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条制造技术

本发明专利技术公开一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条，制备的羊肝片吸虫感染胶体金试纸条可以用于肝片吸虫感染的循环抗原检测，在使用方面具有操作简单、检测快速、携带方便等优点。检测结果直观易懂，便于判读，可以用于肝片吸虫早期感染的检测，并能区分现症感染和既往感染，适用于临床样品现场检测。抗肝片吸虫组织蛋白酶L单克隆抗体保证了本检测方法的特异性。兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体提高了本检测方法的敏感性。克隆抗体提高了本检测方法的敏感性。克隆抗体提高了本检测方法的敏感性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条


[0001]本专利技术涉及一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条，用于羊肝片吸虫感染的检测，属于免疫学


技术介绍

[0002]肝片吸虫病（fascioliasis）是由肝片吸虫（Fasciola hepatica）引起的一种重要的人畜共患寄生虫病，呈世界性流行。该病主要发生于反刍动物，以牛羊居多。肝片吸虫寄生于宿主的肝胆管，引起慢性或急性的肝炎和胆管炎，慢性感染表现为营养障碍和全身性中毒，重症感染可引起幼畜急性死亡，对畜牧业造成巨大的经济损失。
[0003]目前用于检测肝片吸虫感染的方法主要有病原学检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法。病原学检测方法存在漏检的缺点，分子生物学检测方法对仪器设备有很高的要求，免疫学检测方法中的免疫荧光试验（IFA）和间接血凝试验（IHA）为国标方法，但这两种方法需要专业人员，操作过程复杂，对检测条件有一定的要求，在生产基层中不易推广。其次，实验室常用的检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA），该方法同样需要专业的试验人员并配备专业的仪器设备，检测时间较长，同样不适用于基层现场操作使用。现有的免疫学检测方法中多为检测抗体，故不能对肝片吸虫早期感染进行检测，不能区分既往感染和现症感染，不能对药物治疗效果进行评价。目前用于检测肝片吸虫循环抗原的方法较少且比较单一，多为肝片吸虫分泌排泄抗原，存在特异性较差的问题。故很有必要建立一种简单快速，敏感特异，并且可以检测肝片吸虫现症感染和早期感染的试验方法。
[0004]基于胶体金技术制备的胶体金试纸条是一种携带方便，检测快速并且检测结果直观的一种检测方法，在生产基层中极易推广。针对目前我国用于羊肝片吸虫感染的胶体金快速检测试剂盒比较缺乏的现状，本专利技术通过胶体金技术来建立一种检测羊肝片吸虫循环抗原的胶体金试纸条，并对临床样品进行检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条，它具有检测速度快、操作简单、携带方便和不依赖专业仪器等优点，可以用于检测肝片吸虫早期感染和现症感染，适合现场检测。
[0006]本专利技术公开了一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条，通过使用肝片吸虫组织蛋白酶L重组蛋白免疫小鼠和家兔，分别制备单克隆抗体和多克隆抗体，并对抗体进行了纯化；检测线（T）为兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体，质控线（C）为羊抗鼠单克隆抗体。
[0007]本专利技术还公开了一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条的制备方法，是通过利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，用抗肝片吸虫组织蛋白酶L单克隆抗体对胶体金颗粒进行标记并制备金标垫，检测线（T）为兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗
体，质控线（C）为羊抗鼠单克隆抗体，最后组装试纸条。方法主要包括：1、肝片吸虫组织蛋白酶L重组蛋白的表达纯化及抗体制备 将肝片吸虫组织蛋白酶L重组蛋白的阳性表达菌株进行活化并诱导表达，利用切胶回收的方法对重组蛋白进行了纯化。将纯化的肝片吸虫组织蛋白酶L重组蛋白作为抗原，经免疫小鼠以及杂交瘤细胞株的建立和筛选，获得可产生针对肝片吸虫组织蛋白酶L单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。同时以肝片吸虫组织蛋白酶L为抗原，经免疫家兔，制备并纯化兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体。
[0008]2、胶体金试纸条的组装事先裁剪耗材，取21mm的NC膜贴于PVC底板上，保证NC膜表面的清洁。裁剪好的金标垫（8mm
×
3.2mm），金标垫压在NC膜上2mm，样品垫（22mm
×
32mm），压在金标垫上2mm，吸水纸（32mm
×
32mm），压在NC膜上2mm，粘在底板上，按压保证各组装部分粘好。每个试纸条宽4mm，密封干燥保存。取试纸条进行抗体的包被划线，检测线（T）为兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体，质控线（C）为羊抗鼠单克隆抗体。
[0009]本专利技术的积极效果在于：制备的羊肝片吸虫感染胶体金试纸条可以用于肝片吸虫感染的循环抗原检测，在使用方面具有操作简单、检测快速、携带方便等优点。检测结果直观易懂，便于判读，可以用于肝片吸虫早期感染的检测，并能区分现症感染和既往感染，适用于临床样品现场检测。抗肝片吸虫组织蛋白酶L单克隆抗体保证了本检测方法的特异性。兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体提高了本检测方法的敏感性。
附图说明
[0010]图1 肝片吸虫组织蛋白酶L的SDS
‑
PAGE分析；图2 肝片吸虫组织蛋白酶L的SDS
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PAGE分析；图3 单克隆抗体纯度分析；图4 抗体对吸光度值对数曲线图（1
‑
5）；图5 多克隆抗体纯化的SDS
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PAGE分析；图6 兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体的Western Blotting鉴定；图7 胶体金溶液；图8 胶体金溶液最佳pH值的确定；图9 最佳抗体标记量的确定；图10 电镜观察胶体金颗粒；图11 电镜观察标记抗体后的胶体金颗粒；图12 检测线（T）抗体最佳包被浓度的确定；图13 质控线（C）抗体最佳包被稀释度的确定；图14 敏感性试验；图15 特异性试验；图16 重复性试验。
具体实施方式
[0011]通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。
[0012]实施例1肝片吸虫组织蛋白酶L重组蛋白的表达与纯化1、将肝片吸虫组织蛋白酶L重组蛋白的BL21阳性菌株接入LB培养基中，37℃恒温培养活化。活化好的菌株重新接入LB培养基中，37℃恒温培养至菌液OD
600
值为0.6，加入诱导剂，37℃诱导8h。离心弃上清。PBS重悬沉淀并超声破碎。菌液离心取沉淀制样并进行SDS
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PAGE电泳，凝胶用考马斯亮蓝染液进行染色。
[0013]2、将阳性菌株按比例接入大量LB培养基中，按上一步操作制备大量蛋白样品并进行常规SDS
‑
PAGE电泳，凝胶浸泡在KCl溶液中，待目的蛋白区域出现较为明显的条带后，切下条带并用PBS缓冲液洗涤。凝胶碾碎成颗粒状后收集到离心管中，用PBS缓冲液将凝胶颗粒重悬，反复冻融3次后沸水煮20min。室温离心吸取上清，取部分样品测浓度并进行SDS
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PAGE电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染液染色后脱色过夜。
[0014]结果肝片吸虫组织蛋白酶L阳性表达菌株经诱导表达后，蛋白制样经SDS
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PAGE电泳并染色分析可见在约56kDa处有明显的目的条带（图1）。重组蛋白经切胶纯化后，经SDS
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PAGE电泳并染色分析，在约56kDa处有明显的单一条带（图2）。
[0015]实施例2抗肝片吸虫组织蛋白酶L单克隆抗体的制备与纯化1、用纯化的肝片吸虫组织蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条，其特征在于：通过使用肝片吸虫组织蛋白酶L重组蛋白免疫小鼠和家兔，分别制备单克隆抗体和多克隆抗体，并对抗体进行了纯化；检测线（T）为兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体，质控线（C）为羊抗鼠单克隆抗体。2.如权利要求1所述的一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：是通过利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，用抗肝片吸虫组织蛋白酶L单克隆抗体对胶体金颗粒进行标记并制备金标垫，检测线（T）为兔抗肝片吸虫组织蛋白酶L多克隆抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张西臣，刘少雄，于钦磊，张楠，李建华，宫鹏涛，王晓岑，李新，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：