一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法技术

本发明专利技术提供一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法，包括如下步骤：第一步：将活化好的小新月菱形藻进行培养，使其处于对数生长期；第二步：将第一步中处于对数生长期的小新月菱形藻培养液作为种子液，按照10

【技术实现步骤摘要】
一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法


[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，具体为一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法。

技术介绍

[0002]岩藻黄素(Fucoxanthin)，又称岩藻黄质，是一种叶黄素类胡萝卜素，岩藻黄素是一种橙色类胡萝卜素，占自然界类胡萝卜素总产量的10％以上。岩藻黄素具有独特的分子结构，包括5，6
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单环氧化合物、丙二烯，具有多种功能活性。近年来研究发现，岩藻黄素具有多种生理功能和生物学特性，如抗肥胖、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、肝保护以及心脑血管保护作用等。岩藻黄素具有功能食品和药物开发的天然产物，2020年岩藻黄素的全球市场价值为9,500万美元，预计到2026年底将达到1.135亿美元。
[0003]岩藻黄素广泛分布于褐藻、硅藻、金藻及黄绿藻等藻类和海洋浮游植物等。目前，藻黄素来源主要通过海带(Laminaria japonica)、裙带菜(Undaria pinnatifida)等大型海藻提取。然而，大型海藻的岩藻黄素含量低(约为干重的0.01％
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0.1％)、藻细胞壁厚提取纯化工艺复杂、且季节性生长产品质量差，严重限制岩藻黄素的工业开发利用。相比大藻，海洋微藻是更好的岩藻黄素来源。单细胞微藻富含岩藻黄素，其含量为干重的0.2％
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2.6％，为大型海藻的10
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100倍。微藻生长速率快、能在生物反应器内可控制培养、产量不受季节性限制，有利于解决工业化生产岩藻黄素的原料问题。
[0004]现有的研究显示绝大部分微藻通过自养模式积累岩藻黄素，有机碳源的添加限制细胞生长或岩藻黄素积累。小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)是一种海洋真核单细胞硅藻，属于硅藻门(Bacillariophyta)，羽纹硅藻纲(Pennaeae)，管壳缝目(Aulonoraphidinales)，菱形藻属(Nitzschia)，具有自养积累岩藻黄素潜力。然而，小新月菱形藻无法有效吸收有机碳源，难以实现高密度培养，限制岩藻黄素工业生产。葡萄糖作为常用有机碳源，由于其能量转化率最高，用于微藻混养或异养培养。目前，平滑菱形藻(Nitzchia laevis)是报道的唯一可以有效吸收代谢葡萄糖生产岩藻黄素的微藻，诱导驯化不同种的小新月菱形藻有一定生物信息学支撑。利用实验室定向进化体系(ALE)实现微藻自养到混养生产岩藻黄素的转变，对岩藻黄素工业生产具有重要意义。ALE对微藻的生长代谢过程施加压力，使微藻不断适应新的环境，从而向着有益突变进化、改变藻类基因型。与基因工程不同，ALE生成的突变体被普遍认为是安全的(GRAS)。将自养的微藻定向进化为可异养或混养的微藻对细胞高密度培养和高附加值产物生产具有重要意义。异养或混养模式降低微藻细胞对于光照的依赖，增加收获的生物量，从而提高高附加值产物如岩藻黄素和EPA的产量。ALE中微藻的突变周期长(为3个月至2年)，设计策略缩短ALE周期有效提高岩藻黄素生产效率。
[0005]因此有必要设计一种高效的实验室定向进化策略，将自养的小新月菱形藻驯化为可混养生产岩藻黄素的营养模式，目的是获得一种高效生产岩藻黄素小新月菱形藻株。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法，实现小新月菱形藻的混养生长，提高生物量和岩藻黄素产量。
[0007]为达成上述目的，本专利技术提出如下技术方案：一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法，包括如下步骤：
[0008]第一步：将活化好的小新月菱形藻进行培养，使其处于对数生长期；
[0009]第二步：将第一步中处于对数生长期的小新月菱形藻培养液作为种子液，按照10
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20％的接种量转接入已经配好的培养基中进行摇床震荡培养，向培养基中加入葡萄糖，加入葡萄糖的浓度设置为预定数值并逐渐进行提高，培养温度20
‑
30℃，摇床转速为100
‑
240rpm，光照条件下培养9
‑
12天，光质为红光，光照强度为0
‑
200μmol m
‑2s
‑1；由于小新月菱形藻野生型不能吸收代谢葡萄糖，本专利技术利用红光诱导，获得小新月菱形藻G5，可快速吸收代谢葡萄糖，实现混养培养，克服自养微藻不能高密度培养瓶颈。
[0010]第三步：收集藻液，离心洗涤，冷冻干燥，并检测岩藻黄素的含量。
[0011]优选的，所述培养基的组成如下：
[0012]30g/L海盐，750mg/L NaNO3，5mg/L NaH2PO4·
H2O，3.15mg/L FeCl3·
6H2O，4.36mg/L Na2EDTA，0.0098mg/L CuSO4·
5H2O，0.0063mg/L Na2MoO4·
2H2O，0.022mg/L ZnSO4·
7H2O，0.01mg/L CoCl2·
6H2O，0.18mg/L MnCl2·
4H2O，0.001mg/L维生素B
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，0.2mg/L维生素B1，0.001mg/L生物素。
[0013]优选的，光照条件的光源包括太阳光、LED灯或者荧光灯灯光其中的至少一种，光质还包括蓝光或白光。
[0014]优选的，向培养基中加入2g/L、5g/L、10g/L和20g/L的葡萄糖。
[0015]优选的，第一步中的小新月菱形藻为野生型，定义第二步中获得的小新月菱形藻为G5。
[0016]优选的，所述培养基的pH为8.5。
[0017]优选的，所述第三步的具体过程如下：
[0018]取培养液进行离心，洗涤后重新离心，重复2次，将藻液滤至预称重的滤纸上，放入80℃真空干燥箱中烘干至恒重并进行冷冻，称取冻干后的藻粉，低温研磨后加入无水乙醇震荡提取，离心收集上清，沉淀中重新加入无水乙醇震荡提取，直至藻粉呈现白色，收集提取液，对提取液进行离心，取上清液氮气吹干，再加入无水乙醇溶解色素，过膜后高效液相色谱仪分析，整个过程避光条件下进行。
[0019]优选的，高效液相色谱仪为waters2695，配置PDA检测器，检测波长450nm，选用C18反相柱，流动相为：A相为纯乙酸乙酯，B相为乙腈：甲醇：水＝84:2:14，C相为纯甲醇，采用梯度洗脱，流动相均采用HPLC级。
[0020]优选的，所述第一步中，活化好的小新月菱形藻进行培养6
‑
12天。
[0021]有益效果，本申请的技术方案具备如下技术效果：
[0022]1、本专利技术应用红色光质诱导小新月菱形藻吸收低浓度葡萄糖，逐步提高葡萄糖浓度，实现小新月菱形藻的混养生长，提高生物量和岩藻黄素产量，能够用于微藻的实验室定向进化，实现微藻生长模式转变，提高了定向进化的效率，获得混养生长的小新月菱形藻，此外本专利技术提出的方法可用于其他本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法，其特征在于：包括如下步骤：第一步：将活化好的小新月菱形藻进行培养，使其处于对数生长期；第二步：将第一步中处于对数生长期的小新月菱形藻培养液作为种子液，按照10
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20％的接种量转接入已经配好的培养基中进行摇床震荡培养，向培养基中加入葡萄糖，加入葡萄糖的浓度设置为预定数值并逐渐进行提高，培养温度20
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30℃，摇床转速为100
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240rpm，光照条件下培养9
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12天，光质为红光，光照强度为0
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200μmolm
‑2s
‑1；第三步：收集藻液，离心洗涤，冷冻干燥，并检测岩藻黄素的含量。2.根据权利要求1所述的一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方法，其特征在于：所述培养基的组成如下：30g/L海盐，750mg/L NaNO3，5mg/L NaH2PO4·
H2O，3.15mg/L FeCl3·
6H2O，4.36mg/L Na2EDTA，0.0098mg/L CuSO4·
5H2O，0.0063mg/L Na2MoO4·
2H2O，0.022mg/L ZnSO4·
7H2O，0.01mg/L CoCl2·
6H2O，0.18mg/L MnCl2·
4H2O，0.001mg/L维生素B
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，0.2mg/L维生素B1，0.001mg/L生物素。3.根据权利要求1所述的一种小新月菱形藻混养生产提高岩藻黄素产量的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，孙翰，朱常亮，杨淑芳，付晓丹，朱琳，
申请(专利权)人：威海迪普森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：