一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法与应用，是以具有抗肿瘤作用的羧基铂为交联分子，将含有精氨酸与赖氨酸的多肽交联形成铂肽共聚物，再利用静电相互作用与具有诱导细胞凋亡的siRNA混合组装，最后用负电荷脂质体包裹，形成稳定的纳米复合物，最终制成化学/基因协同治疗的纳米传递系统。该纳米传递系统解决了单一疗法治疗效果不佳，siRNA到达肿瘤途中易被降解或清除的问题，具有水溶性，分散性好，稳定性高和生物相容性好等优点。等优点。等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学应用领域，具体涉及一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]在当今社会，癌症是一种严重危害人类健康和生命的疾病。化疗是目前癌症治疗最常用和最有效的方法之一。在各类化疗药物中，铂类药物因其抗癌谱广，治疗效果好而在临床治疗中应用广泛，尤其是顺铂及其衍生物。然而Pt(II)类药物在细胞质环境中易被灭活，从而影响其治疗效果，用预氧化的Pt(IV)配合物被认为是解决这个问题的有效方法，而且可以在其轴向位置引入新基团，有更多化学修饰的可能。
[0003]RNA干扰(RNAi)具有优越的能力，可以通过敲除靶基因来诱导广泛的遗传靶点的有效、持久和特异性沉默，从而达到治疗癌症的效果。siRNA与其他癌症治疗药物相比具有一定的优势，siRNA可以在极低的细胞内浓度下以高度有序特异性的方式提供高效的基因沉默，并且几乎没有任何毒副作用。但因siRNA是一种带负电荷的大分子，容易被血清中的核酸酶所降解，也易被肾脏迅速清除，同时由于其阴离子电荷且亲水性高而导致不易穿过细胞膜，细胞摄取量低。因此如何将siRNA运输到目标癌组织中仍然是一个不小的挑战。
[0004]化疗和基因治疗的联合通过使用选择性化疗药物和功能性基因而展现出巨大的癌症治疗潜力，不仅可以克服多种药物的耐药性，还能达到良好的协同治疗效果。目前已有各种化疗药物和功能性基因的共传递系统被报道，证明了此类药物系统具有明显增强的肿瘤治疗效果，尤其是有通透性增强和保留效应的纳米材料，更适合开发成靶向肿瘤的传递系统。但是由于化疗药物和功能性基因不能独立地负载进纳米颗粒中，从而影响载体结构大小及其负载量，同时由于分子之间的干扰，基因和药物分子也有可能发生非特异性泄漏，这可能会在体循环过程中造成不必要的副作用。
[0005]综上所述，如何开发一个化疗药物和功能性基因互不干扰，尺寸合适，稳定性高，能够安全高效地共传递化疗药物和功能性基因到目标癌组织的系统成为本领域科研人员亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法及其应用，以避免化疗药物和功能性基因(RNA)的互相干扰，减少RNA在运输过程中的损失，能够安全高效地共传递化疗药物和功能性基因到目标癌组织，实现化疗和基因治疗的协同效果。
[0007]本专利技术具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法，其特征是将羧基铂与多肽进行交联形成铂肽共聚物，再利用静电相互作用与siRNA混合组装，最后用负电荷脂质体包裹，形成稳定的纳米复合物。
[0008]本专利技术所采用的多肽具有2
‑
4个赖氨酸残基用于羧基铂的交联反应、具有2
‑
4个精氨酸使多肽在赖氨酸反应后仍具有正电荷，例如KRKRKR或KRFKRFRF。
[0009]本专利技术所采用的多肽单体的电荷较少、不足以有效负载核酸，而在羧基铂的多肽交联具有较多的负电荷，可有效负载核酸。当铂药物从多肽中解离后，多肽复合物解聚，每个单体分子不能有效负载核酸，使核酸释放。
[0010]所述siRNA具有抑制细胞增殖的功能，例如干扰Bcl
‑
2的siRNA。
[0011]所述负电荷脂质体包括生育酚聚乙二醇琥珀酸酯脂质体或双十六烷基磷酸酯脂质体。
[0012]本专利技术具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法，包括如下步骤：
[0013]步骤1：用Rink Amide MBHA树脂固相合成多肽。
[0014]所述多肽包含2
‑
4个赖氨酸残基和2
‑
4个精氨酸残基，例如KRKRKR或KRFKRFRF。
[0015]步骤2：四价羧基铂的合成
[0016]2a、称取顺铂加入圆底烧瓶中，再加入H2O2溶液，60℃～75℃避光搅拌反应3～8h，结束反应，旋蒸除去溶剂，冷却静置，收集沉淀，分别用丙酮和乙醚洗涤，冻干，得到羟基铂；
[0017]2b、称取羟基铂和丁二酸酐加入圆底烧瓶中，加入N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)，40～60℃避光搅拌12～48h，结束反应，冻干除去溶剂，用丙酮溶解，滴加乙醚析出沉淀，收集沉淀，沉淀用乙醚洗涤，冻干沉淀得到四价羧基铂产物Pt(IV)
‑
COOH；
[0018]步骤3：铂肽交联
[0019]将多肽溶于吡啶水溶液或pH＝7.4的PBS溶液中，再将Pt(IV)
‑
COOH、N
‑
羟基丁二酰亚胺(NHS)和1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)溶于水中反应10～60min，然后将两种溶液混合均匀，室温避光搅拌10～24h，冻干除去溶剂后，分别用氯仿和丙酮提纯除去有机小分子杂质，再通过凝胶色谱柱除去杂质，得到铂肽交联产物Pt
‑
AA；
[0020]在上述实施方案中，所述的Pt(IV)
‑
COOH添加的摩尔量是多肽摩尔量的0.5～4倍，N
‑
羟基丁二酰亚胺(NHS)添加的摩尔量是多肽摩尔量的4～8倍，1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)添加的摩尔量是多肽摩尔量的10～20倍。
[0021]步骤4：Pt
‑
AA
‑
RNA
[0022]将铂肽交联产物Pt
‑
AA和siRNA(市购获得)在常温下混合均匀后在超声中组装；AA
‑
RNA以同样的方法制备，用以对比。
[0023]在上述实施方案中，所述的siRNA具有抑制细胞增殖的功能，例如干扰Bcl
‑
2的siRNA和干扰survivin的siRNA。
[0024]在上述实施方案中，所述的铂肽交联产物Pt
‑
AA和siRNA的质量比为50:1～200:1。
[0025]步骤5：Liposome
‑
Pt
‑
AA
‑
RNA(LPR)
[0026]5a、阴离子脂质体(LP)：称取大豆卵磷脂、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯和胆固醇，并将其溶解在氯仿中，通过旋转蒸发除去溶剂，形成均匀的脂质膜，然后加水，并通过超声处理和过滤膜得到阴离子脂质体(LP)；
[0027]在上述实施方案中，所述的脂质体的阴性成分可以是生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)和双十六烷基磷酸酯(DCP)。
[0028]5b、将LP水化，与Pt
‑
AA
‑
RNA混合后进行超声得到LPR。
[0029]在上述实施方案中，所述的Liposome、Pt
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法，其特征在于：以具有抗肿瘤作用的羧基铂为交联分子，与多肽进行交联形成铂肽共聚物，再利用静电相互作用与siRNA混合组装，最后用负电荷脂质体包裹，形成稳定的纳米复合物；所述多肽包含2
‑
4个赖氨酸残基以及2
‑
4个精氨酸残基；所述siRNA具有抑制细胞增殖的功能；所述负电荷脂质体包括生育酚聚乙二醇琥珀酸酯脂质体或双十六烷基磷酸酯脂质体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：铂肽交联将多肽溶于吡啶水溶液或pH＝7.4的PBS溶液中；再将Pt(IV)
‑
COOH、N
‑
羟基丁二酰亚胺和1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶于水中反应10～60min；然后将两种溶液混合均匀，室温避光搅拌12～24h，冻干除去溶剂后，分别用氯仿和丙酮提纯除去有机小分子杂质，再通过凝胶色谱柱除去杂质，得到铂肽交联产物Pt
‑
AA；步骤2：Pt
‑
AA
‑
RNA将铂肽交联产物Pt
‑
AA和RNA在常温下混合均匀后在超声中组装；步骤3：Liposome
‑
Pt
‑
AA
‑
RNA3a、阴离...

【专利技术属性】
技术研发人员：李麦云，刘扬中，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：