蛋白制品中二硫苏糖醇残留量的超高效液相色谱法检测制造技术

公开了一种利用超高效液相色谱UPLC测定蛋白类生物药制品中二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)残留量的方法，包括以下步骤：配制DTT标准品水溶液；获得蛋白样品的滤液；获得超纯水作为空白溶液；DTT标准品、蛋白样品的滤液和超纯水中加入过量的Cu(NO3)2混匀后获得混合物进行UPLC分析，获得DTT峰；将标准品水溶液获得的DTT峰面积相对DTT浓度绘制标准曲线，利用外标法根据测得的DTT峰面积对样品中残留的DTT进行浓度定量。样品中残留的DTT进行浓度定量。

【技术实现步骤摘要】
蛋白制品中二硫苏糖醇残留量的超高效液相色谱法检测
(1)

[0001]本公开涉及生物分析领域，具体涉及一种测定蛋白质样品中二硫苏糖醇DTT残留量的超高效液相色谱(UPLC)检测方法。
(2)
技术介绍

[0002]重组蛋白在生产过程中，经常会有聚合体产生，在蛋白纯化过程中为了防止聚合体产生，确保分子生物活性，会加入一些还原剂。二硫苏糖醇(Dithiothreitol DTT)是一种小分子还原剂，可以用于防止蛋白半胱氨酸残基形成二硫键。
[0003]DTT属于巯基化合物,进入体内可能会破坏蛋白质结构，从而引起酶失活等现象，因此需要严格监控过程中样品以及终产品中的还原剂残留量。根据目前报道，可以利用钴离子反滴定的方法测定DTT含量，但是DTT容易被氧化，而且这种方法灵敏度也不高。此外也有研究人员研究出石墨烯量子点电极检测二硫苏糖醇的方法，这种方法操作简单，灵敏度高，但是限于其制备工艺高昂的价格，工业生产中应用较少。
[0004]高效液相色谱法在工业生产中应用广泛，可以用于检测DTT残留量。其中一种基于液相色谱的测试方法是用单溴二胺(Monobromobimane,mBBr)这种荧光探针对DTT进行衍生，衍生后利用反相液相色谱和荧光检测器对DTT进行定量分析，这种方法灵敏度高，但是样品前处理过程复杂，对反应环境要求严格，不适用于工业生产过程中对DTT残留量的检测。此外也有采用液相色谱法同时对二硫苏糖醇还原态和氧化态两种共存形式进行定量分析的液相色谱法，但是这种方法需要同时生成两种物质的标准曲线，增加检测工作量。
[0005]此外，有报道利用铜离子将DTT全部转化为氧化态，后续用液相色谱进行分析，利用该文献中的液相方法，UV检测LOQ为0.3μg/mL。然而，对于临床给药体积较大的重组蛋白制品而言，DTT在制剂中的含量需要控制在更低浓度范围，针对这种情况目前方法定量限无法确保产品中DTT含量在安全范围内，因此降低方法定量限、提高灵敏度，对确保蛋白制品的安全性有重要意义。基于以上需求，本领域中仍然需要更好的优化DTT的液相分析条件，提高灵敏度的方法。
(3)
技术实现思路

[0006]因此，本专利技术的一个目的是提供一种更灵敏的检测蛋白质生物制品中二硫苏糖醇残留量的UPLC方法。
[0007]因此，本专利技术的一个方面是提供一种利用超高效液相色谱UPLC测定蛋白类生物药制品中二硫苏糖醇DTT残留量的方法，其包括以下步骤：
[0008](1)配制浓度范围为0.001
‑
10μg/mL，优选为0.025
‑
1.0μg/mL的DTT标准品水溶液；
[0009](2)使经纯化后不含细胞碎片和培养基成分的待检测的蛋白样品离心去除蛋白，优选在4℃条件下，优选以14000rcf，更优选在10KD超滤离心管中离心除去蛋白，过滤，获得样品滤液；
[0010](3)分别移取相同体积的超纯水、所述的各DTT标准品水溶液、步骤(2)获得的样品
滤液，分别向其中加入过量的Cu(NO3)2，优选浓度为10mg/mL，混匀后获得混合物进行下一步的UPLC分析；
[0011](4)将步骤(3)获得的混合物上样到UPLC柱上进行色谱分析，以超纯水作为流动相A，含有10％超纯水的乙腈作为流动相B，获得DTT峰；
[0012](5)将标准品水溶液获得的DTT峰面积相对DTT浓度绘制标准曲线，利用外标法根据测得的DTT峰面积对样品中残留的DTT进行浓度定量。
[0013]在该方面的一个具体实施方式中，蛋白类生物药制品包括天然蛋白质或合成蛋白质，例如抗体、酶、融合蛋白；和/或所述蛋白质包含修饰，例如糖基化、甲基化、磷酸化、乙酰化、羟基化修饰；和/或所述蛋白质包含非天然氨基酸，例如D
‑
氨基酸、吡咯赖氨酸。
[0014]在该方面的一个优选实施方式中，步骤(1)中DTT标准品水溶液的配制方法为称取20.0
±
0.2mg DTT粉末于100mL的容量瓶中，加入超纯水定容，配制成200μg/mL的标准品储液；移取1.0mL 200μg/mL DTT标准品储液于100mL容量瓶中，加入超纯水定容，混匀备用，配制成浓度为2.0μg/mL的标准品；再将2.0μg/mL的标准品梯度稀释成浓度为1.0μg/mL、0.50μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.025μg/mL系列标准液。
[0015]在该方面的另一个优选实施方式中，UPLC柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm,2.1*100mm。
[0016]在该方面的另一个优选实施方式中，色谱柱温度为30℃。
[0017]在该方面的还有一个优选实施方式中，步骤(4)包括在285nm检测DTT峰。
[0018]在该方面的一个优选实施方式中，UPLC柱的流速为0.3mL/min；进样量为80μL。
[0019]在该方面的另一个优选实施方式中，色谱测定中梯度洗脱的具体过程为：
[0020][0021]在该方面的还有一个优选实施方式中，还包括在步骤(3)中使用指定浓度的DTT溶液作为方法品控对照，优选为0.025
‑
1.0μg/mL DTT溶液；更优选为0.025μg/mL DTT水溶液。
[0022]本专利技术DTT检测方法的优点是：通过进一步优化液相分析条件，包括色谱柱、洗脱梯度、以及流速等条件，通过制作标准样品的标准曲线，可方便地通过在285nm波长处检测DTT的峰面积进行线性拟合来测定DTT浓度，其检测范围达到了0.025μg/mL～1.0μg/mL，线性关系良好；对于临床给药体积较大的重组蛋白制品而言，能够检测更低浓度范围的DTT残留量，确保产品中DTT含量在安全范围内。
[0023]各种实施方式的其它特征和优势将在下面的说明书中进行部分阐述，并且部分地根据说明书其将是显而易见的，或者可以通过各种实施方式的实践得到了解。各种实施方式的目标和其它优势将通过特别是在说明书和所附权利要求书中所指出的要素及组合得以实现和达到。
[0024]除非另外指出，本专利技术采用的试剂、细胞、以及仪器装置都是普通的市售和公众可
得的。
(4)附图说明
[0025]下面结合附图对本公开作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。
[0026]图1显示了浓度为0.5μg/mL的DTT标准溶液和空白溶液液相谱图。
[0027]图2显示了DTT标准曲线。
(5)具体实施方式
[0028]现在将详细地参考本专利技术的一些实施方式，其中的实例在附图中被阐述。尽管本专利技术结合图解的实施方式进行描述，但是应当理解，它们并非意图使本专利技术限于那些实施方式。相反，本专利技术意图覆盖可以被所附权利要求书限定的本专利技术包括在内所有替换、修改和等价物。
[0029]本专利技术中所使用的超高效液相色谱(Ultra本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用超高效液相色谱UPLC测定蛋白类生物药制品中DTT残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制浓度范围为0.001
‑
10μg/mL，优选为0.025
‑
1.0μg/mL的DTT标准品水溶液；(2)使经纯化后不含细胞碎片和培养基成分的待检测的蛋白样品离心去除蛋白，优选在4℃条件下，优选以14000rcf，更优选在10KD超滤离心管中离心除去蛋白，过滤，获得样品滤液；(3)分别移取相同体积的超纯水、所述的各DTT标准品水溶液、步骤(2)获得的样品滤液，分别向其中加入过量的Cu(NO3)2，优选浓度为10mg/mL，混匀后获得混合物进行下一步的UPLC分析；(4)将步骤(3)获得的混合物上样到UPLC柱上进行色谱分析，以超纯水作为流动相A，含有10％超纯水的乙腈作为流动相B，获得DTT峰；(5)将标准品水溶液获得的DTT峰面积相对DTT浓度绘制标准曲线，利用外标法根据测得的DTT峰面积对样品中残留的DTT进行浓度定量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白类生物药制品包括天然蛋白质或合成蛋白质，例如抗体、酶、融合蛋白；和/或所述蛋白质包含修饰，例如糖基化、甲基化、磷酸化、乙酰化、羟基化修饰，以及PEG修饰、化学小分子修饰；和/或所述蛋白质包含非天然氨基酸，例如D
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：田宇，贺楠，李志国，曹晓林，黄岗，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：