一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法技术

本发明专利技术公开了一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，属于植物组织培养技术领域。选择薄皮核桃的健康青皮果实，清洗后用质量浓度75％的酒精消毒，在超净台内，切去部分青皮露出种壳，撬开后将不带子叶的种胚接种至培养基，培养第28d时污染率、褐化率、褐死率均为0、存活率为100％，种胚生长良好。本发明专利技术未用剧毒试剂升汞和有刺激性的次氯酸钠消毒、消毒试剂未接触种胚、消毒后未用无菌水漂洗、接种时无需将青皮全部去除和将种壳夹开；省时省力省水省试剂省成本、安全环保、优质高效，适于科研和工厂化组培育苗，为核桃继代增殖及建立叶片再生体系用于遗传转化和基因编辑培育新品种奠定技术基础，也可用于其他植物果实种胚的接种。接种。接种。

【技术实现步骤摘要】
一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，更具体的说是涉及一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法。

技术介绍

[0002]植物组织培养技术是植物快繁、种质保存和遗传改良培育新品种的重要技术，而外植体接种是实现组培快繁的第一关，种胚是常用的外植体，尤其是杂交育种后代。
[0003]目前，生产和研究中常用流水冲洗外植体后，用酒精和升汞组合、酒精和次氯酸钠组合对外植体进行消毒，再用无菌水漂洗，然后将消毒后的外植体接种到培养基上。但是，升汞毒性剧烈，使用不当易导致外植体死亡，且使用含有重金属汞离子的废液处理不当会引发环境污染，使用剧毒药品需要报备且在贮存和使用过程中存在安全隐患，因此在使用时较为不便；次氯酸钠相比升汞较为安全，但因为其刺激性、腐蚀性和氧化性强，接触外植体时易使外植体表面损伤褐化，对于幼嫩组织尤为明显，吸入氯气同样危害操作者的健康。
[0004]对于核桃而言，种胚外有种壳、种壳外有青皮，按照传统的接种方法，需经过水洗
→
使用升汞或次氯酸钠溶液消毒
→
无菌水漂洗
→
使用酒精溶液消毒
→
无菌水漂洗
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去掉全部青皮
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夹开种壳
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取出不带子叶的种胚
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使用升汞或次氯酸钠溶液消毒
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无菌水漂洗
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使用酒精溶液消毒
→
无菌水漂洗
→
接种的步骤，存在如下问题：(1)传统消毒方法是在超净台内，将带青皮的核桃放到经过高压灭菌的烧杯中消毒，由于带青皮的核桃直径能达5cm左右，用1000mL的烧杯每次只能消毒几个核桃，消毒效率低。(2)用刀去除青皮时费工费力，而且即便是带着乳胶手套，也容易使手因粘有核桃酚氧化后形成核桃醌而成棕褐色，很难洗掉；(3)由于青皮不容易彻底去除，不易被消毒剂消毒、不易清洗干净，进而容易造成污染，给接种人员带来了操作上的不便；(4)用核桃夹夹开核桃种壳后再取种胚接种的方法，步骤繁琐而难度大且易污染；(5)消毒后无菌水漂洗费水费时且增加种胚污染风险；综上可知，传统的种胚接种方法对于核桃而言操作难度较大、费时、费力、费水、费试剂、成本高、还会造成对环境的污染以及种胚本身的污染，进而损失材料和时间导致不能高效优质完成接种目标，影响组培快繁的后续环节、影响遗传转化或基因编辑培育新品种、影响科研和生产计划，造成经济损失。
[0005]因此，提供一种不用在超净台内进行消毒、不用升汞和次氯酸钠消毒、不用彻底去除青皮、不用核桃夹夹开核桃、消毒后无需无菌水漂洗的接种核桃种胚的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，是一种不用在超净台内进行消毒、不用升汞和次氯酸钠消毒、消毒试剂不直接接触种胚、不用彻底去掉青皮和种壳、不用接种子叶、消毒后不用无菌水漂洗，即可有效完成核桃接种的方法。采用本专利技术方法，种胚在接种后零污染、零褐化、零褐死且正常萌发生长，达到省时省力省
水省试剂省成本、安全环保、优质高效完成核桃的种胚作外植体的接种环节，为后续的核桃继代增殖及建立叶片再生体系用于遗传转化和基因编辑培育新品种奠定坚实的技术基础，也可用于其他植物果实中种胚的接种。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，具体步骤如下：
[0009](1)选取薄皮核桃的带青皮的饱满、无病虫害、无明显机械损伤的健康果实；
[0010](2)将果实清洗后备用；
[0011](3)将清洗后的果实用质量浓度为75％的酒精溶液消毒；
[0012](4)将消毒后的、带着酒精的果实转入超净台中，切去部分青皮，撬开青皮和种壳，取种胚接种至培养基中进行培养。
[0013]一般来说，接种成功的标准是看种胚是否污染、褐化、褐死和存活。本专利技术技术方案的理论基础是：
①
饱满、健康的青皮果实内部的种胚是没有菌的；
②
青皮的外表椭圆光滑易于消毒；
③
薄皮核桃的种壳薄且缝合线浅易撬开；
④
消毒剂只用易挥发的酒精且接触的是青皮，而青皮不用来接种，种胚未接触消毒试剂则不会受到消毒剂毒害，酒精消毒后不用漂洗。正因如此，本专利技术技术方案首先采取在超净台外、仅用质量浓度为75％的酒精溶液消毒青皮核桃，与使用强度较大的酒精溶液加升汞溶液或酒精溶液加次氯酸钠溶液消毒的方法相比，避免了消毒试剂伤害种胚甚至使种胚死亡的风险，也避免了使用升汞和次氯酸钠对环境和操作者带来的安全风险；并且青皮核桃在超净台外可以使用大容积的塑料箱进行密闭消毒，相较于在超净台内用烧杯作容器消毒的方法，操作简单，每次消毒的青皮核桃数量多，消毒效率高。其次，本专利技术将消毒后的、带着酒精的果实转入超净台进行处理，利用酒精能够继续消毒和易挥发的特点，省去了在超净台内消毒及消毒后无菌水漂洗的步骤，省力省时。再次，本专利技术仅切去果柄处部分青皮露出种壳，将开壳器从这儿插入即可撬开青皮和种壳露出种胚，省去了将青皮全部切剥干净再用核桃夹夹开种壳、接种整个核桃种胚的麻烦。总之，该方法突破了固有思路的禁锢，获得了省时省力省水省试剂省成本、安全环保、高效优质的接种效果。
[0014]进一步，所述步骤(1)中带青皮果实为种壳已硬化或半硬化的带青皮果实。
[0015]进一步，所述步骤(2)中清洗后需要擦干。
[0016]进一步，步骤(3)所述用质量浓度为75％的酒精溶液消毒为密闭消毒5～20min，期间适当摇晃。
[0017]进一步，步骤(4)的具体操作为：将消毒后的果实从酒精溶液中捞出，带着酒精，从超净台入口处直接转入超净台内的、无菌的托盘中，切去果柄处部分青皮露出种壳，用无菌的开壳器撬开青皮和种壳，选饱满、洁白、无病虫、不带子叶的种胚接种。
[0018]上述开壳器已在专利号CN201410825986.6，专利名称核桃开口器中公开，具体使用方法见公开专利文件。
[0019]进一步，步骤(4)所述的培养基为在DKW培养基中加入如下质量浓度的组分：6
‑
BA 0.3～0.8mg
·
L
‑1、IBA 0.1～0.3mg
·
L
‑1、蔗糖25～30g
·
L
‑1和琼脂5.5～6.0g
·
L
‑1，所述培养基的pH为5.8～6.2。
[0020]进一步，步骤(4)所述的培养条件为暗培养5d后，转至自然光下培养，光照时间14～18h/d，培养温度为25
±
2℃。
[0021]进一步，培养期间，统计种胚的污染率、褐化率、褐死率、存活率，观察种胚的生长情况。
[0022]进一步，所述的污染率、褐化率、褐死率和存活率的计本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)选取薄皮核桃的带青皮的饱满、无病虫害、无明显机械损伤的健康果实；(2)将果实清洗后备用；(3)将清洗后的果实用质量浓度为75％的酒精溶液消毒；(4)将消毒后的、带着酒精的果实转入超净台中，切去部分青皮，撬开青皮和种壳，取种胚接种至培养基中进行培养。2.根据权利要求1所述的一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，其特征在于，所述步骤(1)中带青皮果实为种壳已经硬化或半硬化的带青皮果实。3.根据权利要求1所述的一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，其特征在于，所述步骤(2)中清洗后需要擦干。4.根据权利要求1所述的一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，其特征在于，步骤(3)所述用质量浓度为75％的酒精溶液消毒为密闭消毒5～20min，期间适当摇晃。5.根据权利要求1所述的一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作为：将消毒后的果实从酒精溶液中捞出，带着酒精，从超净台入口处直接转入超净台内的、无菌的托盘中，切去果柄处部分青皮露出种壳，用无菌的开壳器撬开青皮和种壳，选饱满、洁白、无病虫、不带子叶的种胚接种。6.根据权利要求1所述的一种薄皮核桃...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾玉红，齐国辉，李寒，陈利英，史瑞基，孙权，刘洋，张雪梅，郭素萍，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：