酪氨酸激酶浓度的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种酪氨酸激酶浓度的检测方法及试剂盒。所述检测方法通过电化学发光免疫分析法测定酪氨酸激酶的浓度，包括以下步骤：（1）取酶标板；封闭液封闭，封板膜封板，振荡孵育；（2）孔内加入探针溶液，封板膜封板，2~8℃振荡孵育；（3）在0~4℃的温度下配制标准品溶液和供试品溶液；孔内分别加入标准品溶液和供试品溶液，封板膜封板，振荡孵育；（4）加入第一抗体溶液；（5）加入第二抗体溶液；（6）加显色液显色，记录数据；（7）建立标准曲线，计算供试品溶液中酪氨酸激酶的浓度。本发明专利技术所述的检测方法精密度高、稳定性好，可以用于受体占有率的评价，支持药物临床研究中药效学的评价。支持药物临床研究中药效学的评价。支持药物临床研究中药效学的评价。

【技术实现步骤摘要】
酪氨酸激酶浓度的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种酪氨酸激酶浓度的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002] Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）是一种位于胞质内的非受体酪氨酸激酶，该激酶主要表达于B细胞，是B细胞受体（B cell receptor，BCR）信号通路中的关键激酶。B细胞受体（BCR，B cell receptor）、生长因子和细胞因子受体、G蛋白偶联受体等可以活化BTK。BCR与抗原结合后，诱导下游Lyn、Fyn等Src家族激酶活化，导致BTK迁移到质膜及酪氨酸223位点的自身磷酸化（BTK活化）。活化的BTK随后和B细胞衔接蛋白（BLNK）结合，导致PLC
‑
磷酸化，引起钙离子释放和内流，从而激活NFAT转录因子；同时磷酸化的PLC
‑
激活PKC及MAPK、NF
‑
B及AKT等下游信号通路，导致B细胞的存活、增殖、分化，细胞因子释放，甚至B细胞凋亡。
[0003]BCR信号的活化，可以驱动恶性B细胞的增殖，如慢性淋巴细胞白血病、套细胞林淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤等。活化的BTK调节炎性信号通路，如炎性细胞因子的过表达或错误表达，导致炎性反应的发生，如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病等。近十年，BTK抑制剂（如伊布替尼Ibrutinib、泽布替尼Zanubrutinib）在慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤等的治疗上发挥明显作用。BTK抑制剂的使用，有可能缓解RA等的炎性反应。因此，现今国内外众多厂家争相布局BTK抑制剂，针对不同适应症的BTK抑制剂处于临床前或临床研究的不同时期。
[0004]外周血单个核细胞（PBMC）裂解液中游离BTK的检测，结合PBMC裂解液中总BTK的检测，是验证BTK抑制剂的效果的有效手段，可以用于受体占有率的评价，支持药物临床研究中药效学的评价。然而，现有技术中PBMC裂解液中游离BTK的检测方法稳定性参差不齐，精密度也有待进一步提高。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决现有技术中酪氨酸激酶浓度的检测方法存在的精密度低、稳定性差的缺陷，从而提供了一种酪氨酸激酶浓度的检测方法及试剂盒。本专利技术所述的检测方法精密度高、稳定性好，可以用于受体占有率的评价，支持药物临床研究中药效学的评价。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种酪氨酸激酶浓度的检测方法，其通过电化学发光免疫分析法测定酪氨酸激酶的浓度，包括以下步骤：（1）取酶标板，清洗，拍干；封闭液封闭，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；（2）孔内加入探针溶液，封板膜封板，2~8℃振荡孵育，清洗，拍干；（3）在0~4℃的温度下配制标准品溶液和供试品溶液；孔内分别加入标准品溶液和供试品溶液，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；（4）加入第一抗体溶液，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；
（5）加入第二抗体溶液，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；（6）加显色液显色，使用电化学发光仪测量各孔的发光强度，记录数据；（7）建立标准曲线，计算供试品溶液中酪氨酸激酶的浓度。
[0007]本专利技术中，步骤（1）中，所述振荡孵育的温度较佳地为25
±
1℃。
[0008]步骤（1）中，所述振荡孵育的频率较佳地为600~700rpm。
[0009]步骤（1）中，所述振荡孵育的时间较佳地为60~90min。
[0010]步骤（1）中，所述封闭液可为本领域常规，较佳地为5% BSA
‑
PBS。所述封闭液的加入量一般为每孔加入150
µ
L。
[0011]步骤（1）中，所述酶标板可为本领域常规的酶标板，优选96孔酶标板。所述96孔酶标板的型号例如为Streptavidin MSD/L15SA
‑
1。
[0012]本专利技术中，步骤（2）中，所述探针可为本领域常规的不可逆BTK抑制剂，较佳地为依鲁替尼
‑
生物素（Ibrutinib
‑
biotin）。
[0013]步骤（2）中，所述探针溶液的浓度较佳地为0.15
µ
M。
[0014]步骤（2）中，所述探针溶液的加入量一般为每孔加入50
µ
L。
[0015]步骤（2）中，所述振荡孵育的频率较佳地为600~700rpm。
[0016]步骤（2）中，所述振荡孵育的时间较佳地为20~40min。
[0017]本专利技术中，步骤（2）和步骤（3）中，所述探针溶液、标准品溶液和供试品溶液的溶剂称为稀释液，所述稀释液可为本领域常规，较佳地为BRE溶液，即“1%BSA
‑
RIPA裂解液+2%蛋白酶抑制剂+2%EDTA”。其中，所述蛋白酶抑制剂可以有效抑制哺乳动物细胞或组织提取物中的各种蛋白酶活性，如丝氨酸蛋白酶、氨基肽酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸和天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等。
[0018]本专利技术中，步骤（3）中，所述标准品可为重组BTK蛋白（Recombinant BTK Protein）。
[0019]步骤（3）中，所述标准品溶液的配制方法较佳地为：先配制1000 ng/mL的标准品溶液，然后依次稀释2.5倍，得到系列浓度的标准品溶液。例如，所述标准品溶液的系列浓度分别为0ng/mL（空白）、1.638ng/mL（低锚定点）、4.096 ng/mL（定量下限）、10.24 ng/mL、25.6 ng/mL、64 ng/mL、160 ng/mL、400 ng/mL（定量上限）和1000 ng/mL（高锚定点）。
[0020]步骤（3）中，所述供试品溶液较佳地为含游离BTK的PBMC裂解液。所述PBMC裂解液是用“1%BSA
‑
RIPA裂解液+2%蛋白酶抑制剂+2%EDTA”作为溶液，裂解PBMC细胞制备所得。
[0021]步骤（3）中，所述标准品溶液和供试品溶液的加入量一般分别为每孔加入50
µ
L。
[0022]步骤（3）中，所述振荡孵育的温度较佳地为25
±
1℃。
[0023]步骤（3）中，所述振荡孵育的频率较佳地为600~700rpm。
[0024]步骤（3）中，所述振荡孵育的时间较佳地为60~90min。
[0025]本专利技术中，步骤（4）中，所述第一抗体可为小鼠抗人BTK单克隆抗体（Purified Mouse Anti
‑
Human BTK），较佳地为IgG2a型小鼠抗人BTK单克隆抗体。
[0026]步骤（4）中，所述第一抗体溶液的浓度较佳地为0.25
µ
g/mL。
[0027]步骤（4）中，所述第一抗体溶液的溶剂较佳地为1% BSA
‑
PBS。
[0028]步骤（4）中，所述第一抗体溶液的加入量一般为每孔加入50
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸激酶浓度的检测方法，其通过电化学发光免疫分析法测定酪氨酸激酶的浓度，包括以下步骤：（1）取酶标板，清洗，拍干；封闭液封闭，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；（2）孔内加入探针溶液，封板膜封板，2~8℃振荡孵育，清洗，拍干；（3）在0~4℃的温度下配制标准品溶液和供试品溶液；孔内分别加入标准品溶液和供试品溶液，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；（4）加入第一抗体溶液，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；（5）加入第二抗体溶液，封板膜封板，振荡孵育，清洗，拍干；（6）加显色液显色，使用电化学发光仪测量各孔的发光强度，记录数据；（7）建立标准曲线，计算供试品溶液中酪氨酸激酶的浓度。2.根据权利要求1所述的酪氨酸激酶浓度的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述振荡孵育的温度为25
±
1℃；和/或，步骤（1）中，所述振荡孵育的频率为600~700rpm；和/或，步骤（1）中，所述振荡孵育的时间为60~90min；和/或，步骤（1）中，所述封闭液为5% BSA
‑
PBS；和/或，步骤（1）中，所述封闭液的加入量为每孔加入150
µ
L；和/或，步骤（1）中，所述酶标板为96孔酶标板。3.根据权利要求1所述的酪氨酸激酶浓度的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述探针为依鲁替尼
‑
生物素；和/或，步骤（2）中，所述探针溶液的浓度为0.15
µ
M；和/或，步骤（2）中，所述探针溶液的加入量为每孔加入50
µ
L；和/或，步骤（2）中，所述振荡孵育的频率为600~700rpm；和/或，步骤（2）中，所述振荡孵育的时间为20~40min；和/或，步骤（2）和步骤（3）中，所述探针溶液、标准品溶液和供试品溶液的溶剂称为稀释液，所述稀释液为BRE溶液，即“1%BSA
‑
RIPA裂解液+2%蛋白酶抑制剂+2%EDTA”。4.根据权利要求1所述的酪氨酸激酶浓度的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述标准品为重组BTK蛋白；和/或，步骤（3）中，所述标准品溶液的配制方法为：先配制1000 ng/mL的标准品溶液，然后依次稀释2.5倍，得到系列浓度的标准品溶液；和/或，步骤（3）中，所述供试品溶液为含游离BTK的PBMC裂解液；和/或，步骤（3）中，所述标准品溶液和供试品溶液的加入量分别为每孔加入50
µ
L；和/或，步骤（3）中，所述振荡孵育的温度为25
±
1℃；和/或，步骤（3）中，所述振荡孵育的频率为600~700rpm；和/或，步骤（3）中，所述振荡孵育的时间为60~90min。5.根据权利要求1所述的酪氨酸激酶浓度的检测方法，其特征在于，步骤（4）中，所述第一抗体为小鼠抗人BTK单克隆抗体；和/或，步骤（4）中，所述第一抗体溶液的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：满素勤，陈建军，刘丹，丁俊竹，霍一凡，何倩，
申请(专利权)人：上海益诺思生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：